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      基于免疫磁珠的膠體金免疫層析法同時(shí)檢測(cè)豬肉中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸

      2018-12-15 02:58:32周松劉河冰馬立才丁亞芳張佳林白春陽(yáng)陶曉奇
      食品與發(fā)酵工業(yè) 2018年11期
      關(guān)鍵詞:磁珠離心管膠體金

      周松,劉河冰,馬立才,丁亞芳,張佳林,白春陽(yáng),陶曉奇*

      1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715) 2(北京維德維康生物技術(shù)有限公司,北京,100095)

      喹乙醇和卡巴氧是化學(xué)合成的廣譜類抗菌類藥物,都屬于喹噁琳類藥物(圖1)。該類藥物具有顯著的促進(jìn)生長(zhǎng)和治療、預(yù)防動(dòng)物疾病等作用,常用作飼料添加劑[1-3]。喹乙醇和卡巴氧在動(dòng)物體內(nèi)可分別快速代謝成3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid, MQCA)和喹噁啉-2-羧酸(quinoxaline-2-carboxylic acid, QCA)[4],MQCA和QCA是喹乙醇和卡巴氧殘留檢測(cè)的標(biāo)志物。研究報(bào)道顯示,MQCA和QCA對(duì)人體具有致癌,致突變和致畸等潛在危害,尤其對(duì)人體長(zhǎng)壽細(xì)胞具有較大的危害作用[5]。因此,喹乙醇已經(jīng)被美國(guó)和歐美禁用[6]。同時(shí),在1998年歐盟禁止卡巴氧在動(dòng)物飼料中添加。在中國(guó),喹乙醇藥物在動(dòng)物使用中規(guī)定了最高殘留限量,喹乙醇藥物僅允許在體重少于35 kg的豬的飼料中使用。對(duì)于豬組織和豬肝中的MQCA的最大殘留限量分別為4和50 μg/kg。2003年,糧農(nóng)和世界衛(wèi)生組織專家委員會(huì)要求相關(guān)部門需要規(guī)定出食品MQCA藥物的最高殘留限量和喹乙醇藥物每天最大攝入量[7]。因此,需要靈敏、快速和高通量的檢測(cè)技術(shù)。

      圖1 喹噁琳類藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of quinoxaline antibiotics

      到目前為止,已經(jīng)有較多的方法檢測(cè)在動(dòng)物組織中MQCA和QCA的殘留,包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[7-9],高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[10],高效液相色譜[11-12]。儀器檢測(cè)方法是公認(rèn)的最可靠的檢測(cè)方法,但是繁瑣的樣本前處理,昂貴的設(shè)備,專業(yè)的操作知識(shí)限制了該方法的廣泛應(yīng)用,檢測(cè)規(guī)模也不適用于高通量的快速檢測(cè)要求。

      基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫檢測(cè)方法越來(lái)越多,針對(duì)喹乙醇,卡巴氧及其代謝物免疫檢測(cè)方法主要包括時(shí)間分辨熒光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TR-FIA),酶聯(lián)免疫檢測(cè)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和膠體金免疫層析方法(colloidal gold immunochromatographic assay,CGICA)等[1, 3, 13-15]。在這些方法中,TR-FIA方法,靈敏性較高,需要特殊讀數(shù)儀器,不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè),限制該方法的使用。ELISA方法,可以較準(zhǔn)確定量檢測(cè),但是包括復(fù)雜的試驗(yàn)步驟,主要包括孵育、洗滌、反應(yīng)等,都需要較長(zhǎng)的時(shí)間,對(duì)基質(zhì)干擾和反應(yīng)條件比較敏感,同時(shí)需要特殊設(shè)備(酶標(biāo)讀數(shù)儀),這類檢測(cè)方法不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速定性檢測(cè)。CGICA主要受限于靈敏度低,不能滿足低檢測(cè)限檢測(cè)要求[16]。除此之外,組織中MQCA和QCA的檢測(cè),樣本前處理方法大多是氮吹法[1, 17-19],有機(jī)試劑的使用,不利于環(huán)境友好型要求,同時(shí)需要特殊設(shè)備(氮吹儀)等,限制了這類方法的廣泛應(yīng)用,尤其是現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面。在不斷探索樣本前處理方面,免疫磁珠的出現(xiàn)提供了新的途徑,該方法可實(shí)現(xiàn)高特異性目標(biāo)藥物的提取、快速分離、高倍數(shù)富集,結(jié)合簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法(如CGICA),可同時(shí)解決靈敏度低和檢測(cè)程序繁瑣等問(wèn)題。

      本文建立一種基于免疫磁珠提取、凈化和富集豬肉中MQCA和QCA靈敏的快速膠體金免疫層析定性和定量檢測(cè)方法(圖2)。免疫磁珠分離技術(shù)將分離與富集結(jié)為一體,具有高效、快速和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外尚未見免疫磁珠富集凈化結(jié)合膠體金免疫層析法同時(shí)檢測(cè)豬肉中MQCA和QCA的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬建立以免疫磁珠富集凈化結(jié)合膠體金免疫層析法同時(shí)檢測(cè)豬肉中的MQCA和QCA殘留的方法,以期為豬肉中MQCA和QCA的檢測(cè)提供一種新的有效的檢測(cè)手段。

      圖2 基于免疫磁珠處理的膠體金免疫層析檢測(cè)豬肉中MQCA和QCA流程圖Fig.2 The scheme of CGICA with immunomagnetic beads for the determination of MQCA and QCA in pork

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      MQCA、QCA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA),卵血清蛋白(ovalbumin, OVA),N-二甲基甲酰胺(N-dimethylformamide, DMF),乙基二甲氨基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC HCl),生物素化酯(biotinamidohexanoic acid 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester, BAC-SufoNHS),N-羥基琥拍酰亞胺(NHS)等購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司;KH2PO4,NaH2PO4,NaCl,NaBH4購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司;鏈霉親和素磁珠購(gòu)自于賽默飛世爾科技公司(挪威);磷酸緩沖液(Phosphate buffer, PB.包括NaH2PO4和Na2HPO4);磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-buffered saline, PBS.包括Na2HPO4, KH2PO4, NaCl和KCl)。

      1.2 設(shè)備耗材

      液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS/MS),Waters公司;硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane, NC膜),Millipore公司;卡殼,上海金標(biāo)生物科技有限公司;PVC背板,上海良信科技有限公司;劃膜儀,美國(guó)BioDot公司;噴金儀,日本Hitachi公司;切條機(jī),上海金標(biāo)生物科技有限公司;膠體金免疫層析定量分析儀,北京維德維康生物技術(shù)有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 免疫原和包被原的制備

      半抗原合成方法根據(jù)報(bào)道[14, 20]改進(jìn)得到。戊二醛法合成免疫原和包被原。0.1 mmol MQCA-NH2溶于1 mL DMF溶劑中。BSA或OVA溶于5 mL PBS(0.01 mol/L, pH為7.4),然后逐滴加入到MQCA-NH2溶液中,伴隨攪拌。2 h后逐滴加入甲醛(0.05 mmol),攪拌過(guò)夜。將NaBH4(0.3 mmol)溶于5 mL PBS溶液中,混勻后逐滴加入到過(guò)夜后的反應(yīng)體系中。室溫下攪拌2 h。0.01 moL/L PBS透析8次,于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

      1.3.2 單克隆抗體制備

      單克隆抗體用BALB/c小鼠制備。第1次免疫劑量為100 μg/小鼠,將MQCA-NH2-BSA與弗氏完全佐劑和不完全佐劑乳化后注入小鼠體內(nèi),兩周后加強(qiáng)免疫,免疫的劑量與第1次使用量相同。經(jīng)過(guò)6次免疫后,選出抗體效價(jià)最高的小鼠,取出脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng),通過(guò)直接ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液,篩選出能生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)性能抗體的雜交瘤細(xì)胞,優(yōu)質(zhì)性能主要包括抗體效價(jià)高和特異性高。將篩選的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔,經(jīng)過(guò)2周培養(yǎng),從小鼠腹腔取出腹水,經(jīng)過(guò)免疫親和柱的純化,純化后的抗體放在-20 ℃下備用。

      1.3.3 膠體金免疫層析檢測(cè)卡的制備

      膠體金免疫層析檢測(cè)卡的制備包括膠體金制備,膠體金與抗體偶聯(lián)(膠體金探針),NC膜上T線和C線的包被及檢測(cè)卡整體組裝,組裝后如圖2中檢測(cè)卡所示。膠體金的制備,本文制備直徑為40 nm膠體金顆粒。36 mL 20 g/L的HAuCl43H2O加入到900 mL蒸餾水中加熱至充分沸騰。在攪拌下加入79.5 mL(1%)檸檬酸三鈉溶液,當(dāng)溶液顏色由香蕉黃變成酒紅色,繼續(xù)保持溶液沸騰狀態(tài)10 min,冷卻至室溫,用紫外-可見分光光度計(jì)觀察膠體金顆粒的分散均勻程度和計(jì)算金顆粒直徑大小[3]。膠體金探針的制備,取1g膠體金溶液于1.5 mL離心管中,分別加入10、15、20、25、30、35、40 μL 0.1 moL/L K2CO3調(diào)節(jié)溶液pH,室溫下于3D旋轉(zhuǎn)儀混合反應(yīng)10 min。分別加入0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5和6 μg的MQCA單克隆抗體,快速混勻,室溫下于3D旋轉(zhuǎn)儀混合反應(yīng)10 min,加入20 μL 20% BSA溶液進(jìn)行封閉,室溫下于3D旋轉(zhuǎn)儀混合反應(yīng)10 min,12 000 r/min 離心30 min,移去上清液,用移液器將上清液吸取干凈,加入200 μL復(fù)溶液,超聲混勻1 min,4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將膠體金探針用噴金儀噴在金標(biāo)墊上,37 ℃過(guò)夜烘干,根據(jù)調(diào)試的優(yōu)化條件等比例放大標(biāo)記。

      樣本墊處理方法[21],將玻纖膜用0.1 moL/L PBS(包含有1%BSA,0.5%Tween-20,0.05%疊氮化鈉,pH=7.4)浸泡,然后在60 ℃下烘干2 h。結(jié)合墊用6%蔗糖溶液浸泡,然后于60 ℃下烘干2 h。將膠體金探針用噴金儀均勻噴在結(jié)合墊上(1.2 μL/cm),37 ℃下烘干過(guò)夜。MQCA-NH2-BSA(14.4 mg/mL),羊抗鼠二抗(12 mg/mL)通過(guò)劃膜儀包被在NC膜上分別作為T線和C線,T線和C線的稀釋倍數(shù)分別為2、4、8、12、16、20、24、28倍,劃膜液包被量分別為0.6、0.7、0.8、0.9 μL/cm,最終搭配膠體金探針通過(guò)棋盤法篩選出最佳的T線和C線包被濃度,主要依據(jù)T線和C線的良好的形態(tài)(線不能太細(xì)或者太寬,是很均一的線條)和良好的藥物抑制效果(靈敏度較高)。PVC底板,樣品墊樣品墊樣品墊,結(jié)合墊,NC膜和吸收墊的組裝如圖2所示。

      1.4 樣本前處理

      本實(shí)驗(yàn)采用免疫磁珠提取、分離和富集樣本中MQCA和QCA藥物。主要包括抗體生物素化,免疫磁珠的構(gòu)建,MQCA和QCA的提取,分離,洗脫富集。

      1.4.1 抗體生物素化

      將純化后的MQCA單克隆抗體(19.84 mg/mL)用0.05 mol/L PBS調(diào)整濃度至2~3 mg/mL,加入相應(yīng)量的生物素化酯(BAC-SufoNHS),抗體和生物素化酯的摩爾比例為1/5,25 ℃下旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)2 h,用0.01 mol/L PBS透析8次,獲得生物素化的抗體。

      1.4.2 免疫磁珠的制備

      移液槍吸取鏈霉親和素磁珠1 mg(100 μL 10 mg/mL磁珠混合液),加入到2 mL離心管中,將離心管放入磁力架磁吸30 s,移除液體,將離心管從磁力架中取下,放入離心管架,加入1 mL緩沖液(0.01 mol/L PBS,pH 7.4),加入一定量生物素化抗體,輕輕混勻。室溫下,放入搖床上慢慢搖晃30 min,讓生物素化后的抗體與親和素修飾的磁珠通過(guò)生物親和素作用偶聯(lián)在一起,從而構(gòu)建成免疫磁珠。反應(yīng)30 min后,將帶有混合磁珠液的離心管放入磁力架磁吸30 s,移液槍移除液體,取下離心管放入離心管架,加入1 mL封閉緩沖液(0.01 mol/L PBS中含有0.01% BSA),輕輕混合10 S,放入磁架磁吸30 s,移除液體,依次重復(fù)4次,然后加入1 mL 0.01mol/L PBS重懸備用(1mg/mL),4 ℃下保存。

      1.4.3 免疫磁珠處理實(shí)際樣本

      從本地(重慶超市)購(gòu)買豬肉樣本,經(jīng)過(guò)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)方法[22]挑選出不含MQCA和QCA的陰性樣本,作為空白基質(zhì)。

      1.4.3.1 定性檢測(cè)

      稱5 g勻漿,分別添加一定量MQCA和QCA標(biāo)準(zhǔn)品,使樣本中分別含有0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、4 μg/kg MQCA藥物和0、0.13、0.25、0.63、1.25、2.5、5和10 μg/kg QCA藥物。加入10 mL 0.01 mol/L PBS,渦動(dòng)3 min。4 000 r/min離心5 min,取一定量上清液于新離心管中,分別加入一定量(50、100、150、200、250 μL)的免疫磁珠液,室溫下反應(yīng)8 min。將離心管放入磁力架,磁吸30 s,移去上清液,將離心管從磁力架取下,加入0.01 mol/L PBS到離心管中,混合10 s,離心管放入磁力架,磁吸30 s,如此循環(huán)3次。將洗滌后的帶有磁珠的離心管取下,加入0.02 mol/L PB液復(fù)溶,放入金屬浴中加熱,將吸附在磁珠上的MQCA和QCA藥物洗脫到復(fù)溶液中,復(fù)溶液作為模擬樣本液并用ELISA試劑盒計(jì)算MQCA(QCA)的回收率。檢測(cè)液滴加到檢測(cè)卡上層析5 min,用肉眼觀察T線和C線的相對(duì)深淺判斷樣本中MQCA(QCA)的含量,C和T線顏色一樣深或者T線比C線深時(shí)陰性,C線顏色深,T線顏色比C線顏色淺,或者T線無(wú)色時(shí)是陽(yáng)性,C線不顯色表示無(wú)效。

      1.4.3.2 定量檢測(cè)

      定量檢測(cè)主要包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和方法檢出限和回收率測(cè)定。

      標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立,用免疫磁珠洗脫復(fù)溶液(0.02 mol/L PB)配制MQCA標(biāo)準(zhǔn)曲線(0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、4 μg/kg),用CGICA檢測(cè),每個(gè)樣本重復(fù)3次。5 min后用膠體金免疫層析定量分析儀記錄T/C比值。設(shè)定MQCA為0 μg/kg時(shí),T/C比值為B0,其他濃度時(shí)T/C比值為B。以B/B0為縱坐標(biāo),添加的MQCA濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制出競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線,計(jì)算檢測(cè)卡半數(shù)抑制濃度和定量范圍。

      方法檢出限和回收率測(cè)定,隨機(jī)選取經(jīng)LC-MS/MS檢測(cè)為MQCA陰性的豬肉20份,經(jīng)過(guò)免疫磁珠處理(同定性檢測(cè)免疫磁珠處理方法)后CGICA檢測(cè),每個(gè)樣品測(cè)試3次,以20個(gè)陰性空白樣品的平均值加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為CGICA檢測(cè)限(limit of detection, LOD)。在陰性豬肉中分別添加MQCA和QCA,MQCA的添加濃度 0.1、0.5和2 μg/kg,QCA添加濃度為0.25、1.25和5 μg/kg。根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測(cè)濃度,實(shí)際檢測(cè)濃度與理論濃度的比值百分率即為回收率,重復(fù)檢測(cè) 5次。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 抗原合成

      半抗原的設(shè)計(jì)與合成是制備高靈敏性和高效價(jià)抗體的最重要的步驟。本研究最終形成的半抗原MQCA-NH2結(jié)構(gòu)如圖3所示。合成的半抗原通過(guò)LC-MS/MS方法鑒定,結(jié)果顯示半抗原合成成功(圖4)。

      圖3 半抗原的合成以及包被原和免疫原合成路線圖Fig.3 Synthesis scheme for the novel haptens and hapten-protein conjugates

      圖4 MQCA-NH2半抗原LC-MS/MS鑒定圖Fig.4 The result of synthetic haptens (MQCA-NH2) by LC-MS/MS

      MQCA半抗原是小分子物質(zhì),缺乏免疫原性,需要偶聯(lián)一個(gè)大分子蛋白獲得免疫原性。本文分別將半抗原MQCA-NH2與BSA和OVA偶聯(lián),形成免疫原和包被原,合成過(guò)程如圖3所示,蛋白分子與MQCA-NH2偶聯(lián)時(shí),形成一定的特殊結(jié)構(gòu),蛋白分子和半抗原之間具有一個(gè)連接臂,突出抗原特異性,有利于制備出特異性高的抗體[2, 20]。

      2.2 抗體的特性

      制備的抗體(19.84 mg/mL)的特性主要包括抗體的效價(jià)和交叉反應(yīng)率。制備出的抗體使用間接ELISA方法[18]驗(yàn)證制備抗體的特性。發(fā)現(xiàn)抗體效價(jià)為1/32 000,抗體的IC50(half maximal inhibitory concentration,IC50)和交叉反應(yīng)率如表1所示。

      表1 間接ELISA方法中MQCA抗體的IC50和交叉反應(yīng)率Table 1 The IC50 and cross reactivity of MQCA-mAb inindirect ELISA

      其中,制備出的抗體僅與QCA有40%的交叉反應(yīng)率,與其余的具有相似結(jié)構(gòu)的藥物基本無(wú)交叉,證明該抗體特異性較好。

      2.3 膠體金的紫外掃描圖譜

      通過(guò)肉眼識(shí)別,可以看到膠體金溶液呈現(xiàn)均一的酒紅色。將膠體金溶液在350~600 nm紫外掃描,結(jié)果如圖5所示。

      圖5 膠體金紫外光掃描圖譜Fig.5 Determination of colloidal gold by spectrophotometry

      通過(guò)圖5可以看出制備的膠體金溶液在539.0 nm左右處具有最大的單一吸收峰。在紫外掃描圖譜中,膠體金顆粒直徑和最大吸收峰之間的關(guān)系Dnm=(λmax-505.53)/0.786[23],計(jì)算出膠體金顆粒的直徑為42 nm。在波長(zhǎng)為539 nm附近,掃描曲線的峰寬較小,說(shuō)明膠體金顆粒整體上比較均一。采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法制備膠體金時(shí),檸檬酸三鈉加入量會(huì)影響金顆粒的大小和數(shù)目,在氯金酸總量一定情況下,金顆粒數(shù)目越多,生成金顆粒越小。燒制膠體金的時(shí)間和攪拌速度都會(huì)影響膠體金顆粒的形成,反應(yīng)時(shí)間短,氯金酸沒(méi)有被充分還原,生成的膠體金顆粒不均一,但燒制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則容易發(fā)生聚沉,攪拌太慢反應(yīng)不充分,太快則可能導(dǎo)致溶液飛濺而損失膠體金顆粒。

      2.4 膠體金探針制備與T線和C線的劃膜濃度的參數(shù)優(yōu)化

      根據(jù)膠體金探針最終形成的顏色,是否聚沉和實(shí)際靈敏性等參數(shù),1 g膠體金用于調(diào)節(jié)pH的0.1 mol/L K2CO3的加入量為20 μL,偶聯(lián)的抗體量為2.5 μg??贵w與膠體金連接的作用力主要有靜電引力,疏水作用和配位鍵的相互作用。調(diào)節(jié)體系的pH可以將抗體包含在內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露。當(dāng)pH高于抗體等電點(diǎn),抗體整體呈負(fù)電性,只是其堿基氨基酸為正電性,在合適的pH條件下,抗體與膠體金連接的主要作用力為疏水作用力。高pH時(shí),抗體表面帶正電性增加,導(dǎo)致抗體與膠體金之間斥力增強(qiáng),抗體與膠體金結(jié)合數(shù)目下降,導(dǎo)致膠體金探針與抗原結(jié)合數(shù)目減少,T線顯色變淺。低pH時(shí),抗體與膠體金顆粒之間的疏水作用力很弱,容易出現(xiàn)膠體金聚沉,形成一定的大顆粒,導(dǎo)致膠體金溶液的顏色變化(由酒紅色變?yōu)楹炙{(lán)色)。根據(jù)不同劃膜液稀釋倍數(shù)與膠體金探針的棋盤法實(shí)驗(yàn),得到的優(yōu)化條件為:抗原劃膜(T線)濃度為1.2 mg/mL,劃膜噴量為0.7 μL/cm;羊抗鼠二抗(C線)劃膜濃度為1.0 mg/mL,劃膜噴量為0.7 μL/cm,在該條件下T線與C線顯色均勻,抑制效果較好。

      2.5 磁珠前處理的優(yōu)化

      經(jīng)過(guò)試驗(yàn),優(yōu)化參數(shù)如下,1 mg鏈霉親和素磁珠需要偶聯(lián)MQCA抗體的量為40 μg;800 μL樣本提取液加入0.1 mg(100 μL)免疫磁珠提取效果最佳;最佳的洗脫溫度和時(shí)間分別為85 ℃和3 min。當(dāng)1 mg鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)抗體的量少于40 μg時(shí),磁珠周圍可能還有剩余的抗體偶聯(lián)位點(diǎn),增加抗體用量時(shí)MQCA(QCA)提取的效率提高。當(dāng)加入的抗體量高于40 μg時(shí),多余的抗體可能會(huì)影響后續(xù)藥物的洗脫效率(影響加熱效率)導(dǎo)致藥物回收率下降。800 μL樣本提取液需要的免疫磁珠用量少于0.1 mg時(shí),免疫磁珠的吸附的MQCA總量太少,很難達(dá)到檢測(cè)卡的檢測(cè)限要求(靈敏度低),當(dāng)免疫磁珠加入量高于0.1 mg,造成磁珠浪費(fèi)。洗脫溫度和時(shí)間是影響最終提取MQCA藥物洗脫效率的重要因素。最終結(jié)果表明,85 ℃和3 min是優(yōu)化的洗脫時(shí)間和溫度。洗脫溫度較小時(shí)(<85 ℃),洗脫效果較差,可能由于低熱量不足以使抗原抗體結(jié)合鍵斷裂,過(guò)度的延長(zhǎng)洗脫時(shí)間則不符合快速檢測(cè)的理念。

      免疫磁珠的凈化富集主要包括吸附和洗脫兩個(gè)過(guò)程,吸附是免疫磁珠和樣品中的MQCA或者QCA之間的特異性結(jié)合,從而可以實(shí)現(xiàn)高特異性提取,通過(guò)磁場(chǎng)分離待檢測(cè)藥物與雜質(zhì),凈化效果顯著,大大簡(jiǎn)化后續(xù)檢測(cè)方法的研究,為檢測(cè)新方法的建立奠定了基礎(chǔ),同時(shí)去除基質(zhì)干擾效果較好,可以顯著性提高檢測(cè)方法的靈敏性[24]。根據(jù)豬肉樣本的傳統(tǒng)前處理方法(氮吹法)[1, 13-14],處理時(shí)間為50 min左右,濃縮倍數(shù)為1~2倍,同時(shí)需要使用有毒有害的一些化學(xué)試劑(乙腈或者乙酸乙酯,正己烷等),免疫磁珠的處理時(shí)間更短(30min),濃縮倍數(shù)更高(至少4倍以上),加熱的洗脫方式,減少有機(jī)試劑的摻入,減少后續(xù)檢測(cè)試驗(yàn)的干擾因素,提高方法的穩(wěn)定性。

      2.6 膠體金免疫層析的定性檢測(cè)

      不同濃度MQCA(QCA)藥物添加到陰性樣本中,經(jīng)過(guò)免疫磁珠處理后,處理液滴加到制備的膠體金免疫層析檢測(cè)卡上反應(yīng)5 min后,定性檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

      表2 膠體金免疫層析法定性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination result of the colloidal gold immuno-chromatographic assay in qualitatively detection

      注:根據(jù)顯色結(jié)果判斷:“++++”:顯色深“+++”:顯色較深“++”顯色明顯“+”:顯色較淺“-”:沒(méi)有顯色,或者肉眼無(wú)法辨別。

      陰性樣本,T線顏色微深于C線,當(dāng)加入0.05 μg/kg的MQCA藥物時(shí),T線顏色和C線基本一樣;當(dāng)加入0.1 μg/kg的MQCA藥物時(shí),T線顏色明顯比C線淺,定性檢測(cè)卡的LOD為0.1 μg/kg。分別添加0.25、0.5、1、2和4 μg/kg MQCA時(shí),T線顏色越來(lái)越淺,直至消失。同理可知QCA的定性檢測(cè)限為0.25 μg/kg。ELISA試劑盒檢測(cè)磁珠處理液,平均回收率為92.3%,磁珠處理樣本前處理滿足檢測(cè)需求。定性檢測(cè)能夠根據(jù)需要進(jìn)行快速檢測(cè),尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面。

      2.7 膠體金免疫層析的定量檢測(cè)

      在0.02 mol/L PB中分別加入0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、4 μg/kg MQCA藥物,建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。

      圖6 定性和定量膠體金免疫層析法結(jié)果及定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.6 The result of qualitative and quantitative CGICA and the normalized standard curve of CGICA for MQCA in quantitative method

      曲線方程為y=1.179 2+(4.362 3)/(1+(x/x0)1.145 5),IC50為0.139 0 μg/kg,定量范圍為0.1~4 μg/kg。該曲線方程可以用二維碼帶入,膠體金免疫層析定量分析儀可直接顯示出檢測(cè)樣本的藥物含量,直接出結(jié)果,免去換算的步驟。根據(jù)檢測(cè)限計(jì)算方法的定量檢測(cè)方法的檢測(cè)限為0.1 μg/kg。豬肉樣本的添加回收結(jié)果表3所示,回收率為89.9%~115.2%,變異系數(shù)為6.8%~11.5%。證明該方法(免疫磁珠結(jié)合膠體金免疫層析檢測(cè))可以用于實(shí)際豬肉樣本的快速定量檢測(cè)。

      表3 膠體金免疫層析法定量檢測(cè)回收結(jié)果(n=5)Table 3 Recovery result of the colloidal gold immunoch-romatographic assay in quantitatively detection (n=5)

      本文建立的定性和定量膠體金免疫層析方法靈敏度較高(LOD=0.1 μg/L),是已經(jīng)報(bào)道的TR-FIA方法的1.6倍(LOD=0.16 μg/L),是傳統(tǒng)ELISA方法的2.8倍和19倍[1, 14](LOD=0.28和1.9 μg/L),是已經(jīng)報(bào)道的膠體金方法的4.9和68倍(LOD=0.49和6.83 μg/L)[3, 16]。同時(shí)結(jié)合免疫磁珠的快速、高特異性和高倍數(shù)富集作用,可作為豬肉中MQCA或者QCA的殘留檢測(cè)技術(shù)。

      2.8 膠體金免疫層析方法(定量)與LC-MS/MS測(cè)定結(jié)果比較

      根據(jù)隨機(jī)選取的20份市售豬肉,采用膠體金免疫層析方法和LC-MS/MS[22]同時(shí)定量檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如表4所示,其中13份陰性樣本,7份陽(yáng)性樣本。其中,CGICA的檢測(cè)結(jié)果為MQCA+QCA的總量,該方法以MQCA為標(biāo)準(zhǔn)品建立的檢測(cè)方法,檢測(cè)的結(jié)果直觀以MQCA含量表示。

      表4 CGICA和LC-MS/MS對(duì)20份豬肉樣本的檢測(cè)結(jié)果 單位:μg/kg

      注:ND表示未檢出。

      LC-MS/MS能分別直觀顯示MQCA和QCA的含量。另外,文中MQCA+QCA的值與LC-MS/MS的值有差異,原因是MQCA的交叉反應(yīng)率為100%,QCA交叉反應(yīng)率為40%。根據(jù)交叉反應(yīng)率計(jì)算知,LC-MS/MS和CGICA檢測(cè)結(jié)果一致性較好,證明建立的CGICA方法準(zhǔn)確,可靠。

      3 結(jié)論

      本文建立一種方便、快速和靈敏的用于豬肉中MQCA和QCA的定性和定量的膠體金免疫層析方法,定性和定量檢測(cè)限為0.1 μg/L。免疫磁珠簡(jiǎn)化樣本前處理,可高特異性提取豬肉中的MCA和QCA藥物。可在30 min內(nèi)完成樣本的前處理,5 min完成定性定量檢測(cè),肉眼視覺(jué)直接判斷陰陽(yáng)性(定性),通過(guò)儀器識(shí)別內(nèi)置二維碼直接顯示檢測(cè)的MQCA和QCA含量,可以根據(jù)需要靈活地選擇檢測(cè)方式,快速方便。本文建立的CGICA與LC-MS/MS的測(cè)量結(jié)果一致性很好,證明該方法準(zhǔn)確、可靠,可用于豬肉樣本中MQCA和QCA藥物的非法殘留,可為我國(guó)的食品安全檢測(cè)提供一種有效的檢測(cè)手段。

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