蛋白質(zhì)多肽酶解及分離新技術(shù)的改進

劉寶陽，張 磊，范志娟，田亞瓊，劉樹業(yè)△

(1.天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院檢驗科/天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院，天津 301800； 2.天津市第三中心醫(yī)院檢驗科 300170)

蛋白質(zhì)組是指“由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部蛋白質(zhì)”[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對象，分析細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組成成分和表達水平，進一步認識生命活動規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)分析不僅僅是一種方法學(xué)，而是各種分離技術(shù)、鑒定技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)的有機整合。因此如何提高分離技術(shù)，是進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)。本研究將Self-owned胰蛋白酶、強陽離子交換與反相C18二維一體毛細管色譜柱聯(lián)合用于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中，旨在探討其在蛋白質(zhì)組分析和表達方面的優(yōu)勢，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 選擇不同濃度的牛血清清蛋白(BSA)，分為高濃度(6.5 μg/mL)、中濃度(6.5×10-3μg/mL)、低濃度(6.5×10-6μg/mL)及極低濃度(6.5×10-8μg/mL)。

1.2實驗儀器 納升級高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；LTQ-Orbitrap XL質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司)；強陽離子交換與C18反相二維一體毛細管色譜柱(北京譜之源公司)。

1.3方法 分別用Promega和自主修飾的Self-owned的胰蛋白酶酶解不同濃度的BSA，觀察其不同胰蛋白酶的酶解效能。采用強陽離子交換與反相C18二維一體毛細管色譜柱，將不同分離模式的色譜柱以串聯(lián)方式合并于同一色譜柱中，即在同一色譜柱的前部分填裝強陽離子色譜材料，后部分填裝C18反相液相色譜材料。將所制備的二維一體毛細管色譜柱用于分離標(biāo)準(zhǔn)BSA提取液的分離分析，并以峰容量、BSA鑒定的覆蓋率及信號強度作為特征參數(shù)，觀察其色譜柱的性能差異，評價二維一體毛細管色譜柱的柱能。

2 結(jié) 果

2.1Self-owned自主修飾胰蛋白酶的性能

2.1.1高活性 經(jīng)過修飾的高活性、穩(wěn)定的分子，無自催化作用，減少自水解產(chǎn)生多余肽段。4種不同型號的胰蛋白酶(tryp_auto為國產(chǎn)任一品牌，Pro_10為美國Promega公司生產(chǎn)，HLS_10及HLS_5均為自修飾)無論從蛋白鑒定種類及不同胰酶間鑒定結(jié)果相互覆蓋的角度，自主修飾的胰蛋白酶酶解效能均好于其他種類胰酶。見圖1。

2.1.2不自殘 經(jīng)L-1(對-甲苯磺酰)苯丙胺酰氯甲酮(TPCK)處理，滅活了殘留的胰凝乳蛋白酶活性。

2.1.3高純度 經(jīng)多次色譜系統(tǒng)純化純度達到最優(yōu)，其自主修飾Self-owned的胰蛋白酶的雜峰遠少于Promega胰蛋白酶。

2.2nanoHPLC-MS技術(shù)平臺 利用1D分離技術(shù)獲取由自主修飾Self-owned與Promega胰蛋白酶酶解不同濃度BSA的總離子流圖(TIC)。高、中濃度BSA經(jīng)酶解后的TIC，其兩種酶效能持平，具有較好的重復(fù)性；在低濃度的BSA中發(fā)現(xiàn)自主修飾Self-owned胰蛋白酶的檢出信號要優(yōu)于Promega胰蛋白酶。

圖1 不同種類胰蛋白酶酶解效能統(tǒng)計圖

2.3鑒定不同濃度BSA的覆蓋率 利用Proteome Discoverer軟件分析經(jīng)胰蛋白酶酶解后不同濃度BSA的覆蓋率，其經(jīng)自主修飾Self-owned胰蛋白酶酶解的BSA的覆蓋率略高于Promega胰蛋白酶。見表1。

表1 不同濃度BSA的覆蓋率(%)

2.4不同胰蛋白酶酶解不同濃度BSA的覆蓋率 用二維一體毛細管色譜柱將不同胰蛋白酶酶解不同濃度BSA酶切液進行分離，即在完全相同的實驗條件下，實驗結(jié)果表明將自主修飾Self-owned胰蛋白酶與二維一體毛細管色譜柱整合后，其分離效果更好，具有較高的靈敏度，特別是在上樣量極低的情況下。見表2。

表2 不同胰蛋白酶酶解不同濃度BSA的覆蓋率(%)

表3 二維一體毛細管色譜柱的重復(fù)性

2.5二維一體毛細管色譜柱的重復(fù)性 分別依照完全相同的分離條件，分析經(jīng)自主修飾Self-owned胰蛋白酶酶解的BSA酶切液，重復(fù)做兩次，選取BSA酶切的肽段混合物中相應(yīng)強度較高的質(zhì)荷比(m/z)740.4為特征肽段，分別記錄其保留時間(RT)及信號強度(AH)，作為考察色譜柱重復(fù)性的指標(biāo)，結(jié)果顯示所制備的二維一體毛細管色譜柱具有良好的重復(fù)性。見表3。

3 討 論

蛋白質(zhì)組研究的關(guān)鍵技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離、鑒定及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組研究方法是將二維凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合起來[2-3]。其中蛋白質(zhì)分離技術(shù)包括雙向電泳和色譜技術(shù)，雙向電泳操作簡便、快速但也存在諸多缺點，例如拷貝數(shù)較低的蛋白質(zhì)不容易檢測、過大或過小的蛋白質(zhì)分子不容易分離和手工操作不穩(wěn)定等[4]。由于雙向電泳技術(shù)存在的缺陷，科研中需要升級和探索更好的蛋白質(zhì)分離和鑒定技術(shù)。因此越來越多的高效分離技術(shù)，如高效液相色譜和毛細管電泳等應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中[5]。

胰蛋白酶作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一部分，其高效和完整的蛋白水解在蛋白質(zhì)組研究中非常重要[6]。胰蛋白酶主要由豬或牛胰臟中獲取，但胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶均從胰臟制備，通常不容易完全分開，專一性不好。但經(jīng)對甲苯磺酰氯甲烷(TCPK)修飾后的胰蛋白酶，可以抑制殘留的胰凝乳蛋白酶活性提高純度[7]。本研究所用的Self-owned胰蛋白酶滅活了殘留的胰凝乳蛋白酶活性，減少自消化，提高了酶的純度和催化活性，其充分的酶解更有利于分離技術(shù)的提高。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)之一就是高效分離，這也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中需要繼續(xù)追尋的目標(biāo)[8]?；谝合嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白質(zhì)組研究分析方法中，大多采用的是毛細管液相色譜分離系統(tǒng)，為此目前研究的關(guān)鍵技術(shù)就在于毛細管色譜柱的選擇和制備[9-10]。本研究中自制的二維一體毛細管色譜柱，可以消除鍵合缺陷造成的樣品污染并具有超高分辨率和重復(fù)性，目的是有效提高蛋白質(zhì)組鑒定覆蓋率和蛋白質(zhì)鑒定序列覆蓋率。結(jié)果表明自制二維一體毛細管色譜柱，具有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可以高效分離。

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究需要高效分離、高靈敏度、高通量和動態(tài)范圍寬的分析技術(shù)平臺。本研究首先利用Self-owned胰蛋白酶酶解BSA，結(jié)果證明其酶解效能良好，再利用自制二維一體毛細管色譜柱分離BSA觀察柱效，經(jīng)過比較結(jié)果表明自制二維一體毛細管色譜柱具有超高分辨率和重復(fù)性。

綜上所述，將Self-owned胰蛋白酶和自制二維一體毛細管色譜柱聯(lián)合用于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中，可以顯著增加蛋白質(zhì)數(shù)量的檢出率，有助于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，利于大規(guī)模高通量蛋白質(zhì)分析和鑒定。