顯微鏡觀察藥物敏感性技術(shù)在菌陰肺結(jié)核中的診斷價(jià)值

付佑輝，張 舒，池 峰，李 挺，范艷紅，生淑紅

(上海市第七人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 200137)

結(jié)核病是危害人類健康重大傳染病之一。在我國(guó)，菌陰肺結(jié)核患者數(shù)占活動(dòng)性肺結(jié)核患者總數(shù)的73.5%，如何提高這類患者的病原學(xué)檢出率，并有效、快速地作出早期診斷，對(duì)肺結(jié)核的診治、防控具有十分重要的作用[1]。支氣管肺泡灌洗液(BALF)是利用支氣管鏡對(duì)相應(yīng)病變部位的肺段或亞段灌注一定量的無(wú)菌生理鹽水后回吸采集的肺泡表面襯液。對(duì)不容易留取或干咳無(wú)痰的患者進(jìn)行經(jīng)支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)，更接近病灶采集樣本，可以有效提高病原體檢出率。顯微鏡觀察藥物敏感性檢測(cè)技術(shù)(MODS)是近年來(lái)報(bào)道的一種新的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)技術(shù)，具備快速、簡(jiǎn)便、靈敏、價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。本研究將MODS應(yīng)用于菌陰肺結(jié)核患者肺泡灌洗液中結(jié)核分枝桿菌(MTB)的檢測(cè)，將其與肺泡灌洗液羅氏培養(yǎng)法、抗酸染色涂片法的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，并對(duì)其在菌陰肺結(jié)核中的臨床診斷價(jià)值初步進(jìn)行評(píng)價(jià)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2013年1月1日至2016年12月31日本院結(jié)核科門診就診的90例菌陰肺結(jié)核患者的肺泡灌洗液標(biāo)本，以及60例呼吸科住院的非肺結(jié)核肺部疾病(包括慢性支氣管炎、肺炎、支氣管擴(kuò)張、肺癌等)患者的肺泡灌洗液標(biāo)本。其中菌陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《肺結(jié)核診斷和治療指南》[4]執(zhí)行。

1.2試劑與儀器 對(duì)硝基苯甲酸(PNB)購(gòu)自Sigma公司。其儲(chǔ)存液的制備方法：將PNB純藥粉溶解在0.1 mol/L氫氧化鈉中，再取0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至6.5；加無(wú)菌蒸餾水制成5 mg/mL儲(chǔ)存液，然后將上述配置好的儲(chǔ)存液用無(wú)菌濾膜過(guò)濾、分裝，-20 ℃保存。應(yīng)用時(shí)取出，常溫下溶解，倍比稀釋，配置成2倍于終濃度為800 μg/mL(即濃度為1 600 μg/mL)的工作液。液體培養(yǎng)基的干粉為Middlebrook 7H9(購(gòu)自美國(guó)Difico公司)，營(yíng)養(yǎng)添加劑OADC(購(gòu)自Becton Dickinson公司)。配置含10%營(yíng)養(yǎng)添加劑的Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基為應(yīng)用液。具體配置方法按文獻(xiàn)[2]進(jìn)行。羅氏培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基按《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》制備[5]。MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv，ATCC 25177)購(gòu)自國(guó)家菌種保藏中心。所用儀器包括倒置顯微鏡(XDS-1B 重慶光電儀器有限公司)和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(TPP，瑞士進(jìn)口)。

1.3方法 患者的BALF標(biāo)本采集方法如下：根據(jù)患者的胸部CT資料，選擇支氣管肺段病變部位作為灌洗的位置，然后將10～25 mL生理鹽水通過(guò)支氣管鏡灌入支氣管肺段的相應(yīng)部位；然后通過(guò)負(fù)壓(壓力為25～100 mm Hg)吸引BALF至瓶中。此操作可以重復(fù)灌洗2～3次，收集BALF為15～20 mL左右。

1.3.1MODS培養(yǎng)法 將150例患者肺泡灌洗液化去污染處理(方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[5])后的沉淀，用液體培養(yǎng)基洗滌2遍，用6 mL液體培養(yǎng)基重懸。運(yùn)用MODS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)并同步將其接種至羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。操作如下：每塊24孔細(xì)胞培養(yǎng)板做11份肺泡灌洗液樣本，每塊作為檢測(cè)的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板共設(shè)置11個(gè)檢測(cè)孔、11個(gè)鑒別孔及2個(gè)陰性對(duì)照孔。首先將0.4 mL無(wú)菌的液體培養(yǎng)基分別加入到11個(gè)檢測(cè)孔、在11個(gè)鑒別孔內(nèi)分別加入0.4 mL配制PNB工作液；在2個(gè)陰性對(duì)照孔中加入0.4 mL的無(wú)菌液體培養(yǎng)基和0.4 mL無(wú)菌生理鹽水，然后將0.4 mL肺泡灌洗液樣本沉淀懸濁液分別加入到檢測(cè)孔和鑒別孔內(nèi)，混勻用膠帶密封，放置密封的塑料袋內(nèi)，然后將密封好的細(xì)胞培養(yǎng)板置入37 ℃孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。從放入孵箱后的第3天起用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察(×10目鏡，×40物鏡)，每天觀察1次，第15天后每周觀察2次，至第40天結(jié)束。若在檢測(cè)孔內(nèi)觀察到呈索狀結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)的細(xì)菌，含PNB鑒別孔無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，則說(shuō)明該樣本中有MTB生長(zhǎng)；若檢測(cè)孔及含PNB鑒別孔內(nèi)均觀察到呈索狀結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)的細(xì)菌，則說(shuō)明樣本中有非MTB生長(zhǎng)；若鑒別孔及檢測(cè)孔內(nèi)均未觀察到呈索狀結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)的細(xì)菌，則分別從檢測(cè)孔及鑒別孔中吸取少量標(biāo)本液，進(jìn)行抗酸染色涂片鏡檢，如抗酸染色涂片結(jié)果為陽(yáng)性，可判斷該樣本為無(wú)索狀結(jié)構(gòu)的非MTB；如抗酸染色涂片結(jié)果為陰性，則可判斷該樣本中無(wú)分枝桿菌生長(zhǎng)；如陰性對(duì)照孔出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)，判斷為污染。每批樣本檢測(cè)以H37Rv為質(zhì)控株(具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[6])。

1.3.2羅氏培養(yǎng)和鑒定 取經(jīng)前處理后肺泡灌洗液標(biāo)本0.1 mL無(wú)菌接種于羅氏培養(yǎng)基斜面上，將每份標(biāo)本同時(shí)接種在2支羅氏培養(yǎng)基、1支含PNB羅氏培養(yǎng)基(PNB藥物濃度為500 mg/mL)及1支含噻吩-2-羧酸肼(TCH)羅氏培養(yǎng)基(TCH藥物濃度為5 mg/mL)上，放37 ℃溫箱孵育，具體方法操作參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]執(zhí)行。

1.3.3涂片抗酸染色 用接種環(huán)挑取肺泡灌洗液0.1 mL，于玻片正面右側(cè)2/3中央處均勻涂抹成10 mm×20 mm左右橢圓形灌洗液膜，將灌洗液膜靜置自然干燥后進(jìn)行抗酸染色，具體方法操作參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]執(zhí)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(P25，P75)]表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MODS與羅氏培養(yǎng)法所需時(shí)間比較 應(yīng)用MODS對(duì)150例患者肺泡灌洗標(biāo)本中MTB進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性檢出時(shí)間為5～28 d，中位時(shí)間為[11.0(7.5，18.5)]d，而羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間為12～48 d，中位時(shí)間為[20.0(14.9～34.9)]d，MODS檢測(cè)時(shí)間短于羅氏培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 MTB特征性索狀結(jié)構(gòu)(×40物鏡)

2.23種方法檢測(cè)結(jié)果比較 在90例臨床確診為菌陰肺結(jié)核患者的肺泡灌洗液樣本中，抗酸染色涂片法、羅氏培養(yǎng)法及MODS檢測(cè)的MTB陽(yáng)性分別為20例(22.2%)、30例(33.3%)和46例(51.1%)，陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.68，P<0.001)。60例非結(jié)核的肺部疾病患者肺泡灌洗液樣本檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果分別為2例(3.3%)、2例(3.3%)和1例(1.7%)，假陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.54，P>0.05)。90例臨床確診為菌陰肺結(jié)核患者肺泡灌洗液樣本的檢測(cè)結(jié)果表明，MODS與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法結(jié)果符合率為71.1%，如以羅氏培養(yǎng)法為判斷標(biāo)準(zhǔn)，則MODS檢測(cè)MTB的靈敏度為83.3%(25/30)、特異性65%(39/60)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)54.3%(25/46)、陰性預(yù)測(cè)值(NPV)88.6%(39/44)、正確性為71.1%(64/90)；MODS與羅氏培養(yǎng)法結(jié)果進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.52，P<0.05)。MTB在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)所呈現(xiàn)的特征性索狀結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

3 討 論

菌陰肺結(jié)核是指3次痰涂片和1次痰培養(yǎng)檢查MTB均為陰性的肺結(jié)核患者。在我國(guó)肺結(jié)核患者中，有50%～70%的患者為菌陰肺結(jié)核。由于菌陰肺結(jié)核患者痰里面找不到MTB，因此它的診斷缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”，給診斷帶來(lái)困難，臨床上很容易發(fā)生漏診、誤診、漏治、誤治、甚至過(guò)治，這樣不僅給患者增加了經(jīng)濟(jì)、心理負(fù)擔(dān)，也給社會(huì)帶來(lái)一定負(fù)擔(dān)和危害。因此，如何對(duì)菌陰肺結(jié)核進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地診斷，一直是臨床急需解決難題之一。實(shí)際上，結(jié)核病患者，甚至無(wú)臨床表現(xiàn)的結(jié)核潛伏感染者體內(nèi)都應(yīng)存在MTB。這是結(jié)核病發(fā)病首要及必須的條件。就細(xì)菌學(xué)而言，不存在所謂的“菌陰”肺結(jié)核，只是限于采用常規(guī)方法未能從痰標(biāo)本檢出分枝桿菌而已。因此，菌陰肺結(jié)核不是一個(gè)固定的概念，它受檢測(cè)技術(shù)靈敏度、特異度的限定。為此，尋找快速、敏感、特異、準(zhǔn)確的結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷新技術(shù)，對(duì)菌陰肺結(jié)核的診治將具有十分重要的意義。2000年，有研究者建立了一種結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷新技術(shù)——MODS，通過(guò)倒置顯微鏡對(duì)MTB的特征性索狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀測(cè)，來(lái)確定是否有MTB生長(zhǎng)[3]。該技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便、價(jià)廉等特點(diǎn)。隨后，有研究將其用于結(jié)核病的快速診斷，顯示出良好的應(yīng)用前景[7-9]。

本研究通過(guò)應(yīng)用MODS檢測(cè)肺泡灌洗液中MTB，探討其對(duì)菌陰肺結(jié)核的診斷價(jià)值，國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)較少。本研究選擇肺泡灌洗液樣本主要原因有：(1)BALF是通過(guò)支氣管鏡將無(wú)菌生理鹽水灌注至病變部位直接獲取，這樣不但能獲取較大數(shù)量細(xì)菌，而且一定程度上避免了口咽部細(xì)菌對(duì)標(biāo)本的污染；(2)對(duì)于支氣管鏡不能到達(dá)的遠(yuǎn)端病灶，BALF可根據(jù)影像學(xué)提示的病灶位置，通過(guò)支氣管鏡灌注生理鹽水后的沖洗作用，在一定程度上引出遠(yuǎn)端病灶結(jié)核桿菌，這樣增加樣本MTB的獲得概率；(3)通過(guò)支氣管鏡檢查的激發(fā)、沖洗作用，可疏通、引流病灶的支氣管，從而提高樣本MTB的獲得概率。本研究納入的所有菌陰肺結(jié)核組患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)均嚴(yán)格參照2001年中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定的菌陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，具有較高的可信度和可比性[4]。筆者將兩組患者肺泡灌洗液進(jìn)行MODS檢測(cè)的同時(shí)，還將其與傳統(tǒng)的抗酸染色涂片法和羅氏培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較，研究結(jié)果表明MODS檢測(cè)肺泡灌洗液中MTB的陽(yáng)性檢出率顯著高于涂片法和羅氏培養(yǎng)法(P<0.05)，羅氏培養(yǎng)法是目前公認(rèn)簡(jiǎn)便的結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，如以它為判斷標(biāo)準(zhǔn)，MODS法具有較高的靈敏度(83.3%)，但總體的陽(yáng)性檢出率、檢測(cè)時(shí)間中位數(shù)、特異度與WALUSIMBI等[9]報(bào)道的數(shù)據(jù)相比偏低，可能與選用的肺泡灌洗液樣本多數(shù)來(lái)自治療后的菌陰肺結(jié)核患者有關(guān)，其服藥后肺泡灌洗液中可能有大量死菌存在，或者細(xì)菌活力較低。

綜上所述，將MODS用于肺泡灌洗液樣本中MTB的檢測(cè)，只需支氣管鏡、孵箱及顯微鏡就能進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低廉[10]，可以滿足臨床對(duì)MTB快速檢測(cè)的需求，加上本法檢測(cè)的是活菌，因此可作為菌陰肺結(jié)核細(xì)菌學(xué)快速檢測(cè)的新方法之一，具有良好應(yīng)用前景。