MGMT及表皮生長因子受體在喉鱗癌中的表達(dá)及對預(yù)后的影響

宋曉曉 林刃輿

[摘要] 目的 研究探討喉鱗狀細(xì)胞癌中MGMT及表皮生長因子受體蛋白的表達(dá)與臨床資料間的關(guān)系及其對治療預(yù)后的影響。 方法 標(biāo)本均選取2016年1月～2017年6月于我院耳鼻喉科手術(shù)治療的93例喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）患者的石蠟切片，經(jīng)病理學(xué)確診為LSCC標(biāo)本。選取20例健康喉黏膜組織標(biāo)本作為對照組。采用免疫組化染色法檢測O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT）與表皮生長因子受體蛋白（epidermal growth factor receptor，EGFR）的表達(dá)水平。評價腫瘤組與對照組之間MGMT、表皮生長因子受體蛋白（EGFR）的表達(dá)差異；評價腫瘤組中MGMT、EGFR的表達(dá)水平與其各項(xiàng)臨床資料間的關(guān)系；評價腫瘤組中MGMT與EGFR表達(dá)之間的關(guān)系。 結(jié)果 腫瘤組與對照組之間MGMT、EGFR的表達(dá)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；腫瘤組中MGMT、EGFR的表達(dá)水平與病理分期和分化程度呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）；腫瘤組中MGMT與EGFR表達(dá)呈正相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論 本次研究證明喉鱗狀細(xì)胞癌中MGMT、EGFR的表達(dá)與病理分期和分化程度呈正相關(guān)，MGMT、EGFR的高表達(dá)往往意味著腫瘤預(yù)后不良且比通過疾病分期預(yù)后更為準(zhǔn)確。MGMT、EGFR的表達(dá)作為LSCC的生物指標(biāo)值得臨床推廣。

[關(guān)鍵詞] 喉鱗狀細(xì)胞癌；表皮生長因子；MGMT；預(yù)后；免疫組化染色

[中圖分類號] R739.65 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）24-0060-04

Expression of MGMT and epidermal growth factor receptor in laryngeal squamous cell carcinoma and its effect on prognosis

SONG Xiaoxiao LIN Renyu

Department of Otolaryngology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the expression of MGMT and epidermal growth factor receptor（EGFR） and clinical data in laryngeal squamous cell carcinoma and its effect on the prognosis of treatment. Methods Paraffin section of 93 cases of Laryngeal squamous cell carcinoma（LSCC） who were treated in the Department of Otolaryngology in our hospital from January 2016 to June 2017 were selected. All the specimens were pathologically confirmed as LSCC specimens. 20 specimen of healthy laryngeal mucosa were selected as control group. The expression of O6-methylguanine-DNA-methyltransferase （MGMT） and epidermal growth factor receptor（EGFR） was detected by immunohistochemical staining. The differences in expression of MGMT and epidermal growth factor receptor（EGFR） protein between tumor group and control group were evaluated. The relationship between MGMT， EGFR expression levels and their clinical data in tumor groups was evaluated. The relationship between MGMT and EGFR expression in tumor groups was evaluated. Results There were significant differences in the expression of MGMT and EGFR between the tumor group and the control group （P<0.05）. The expression levels of MGMT and EGFR in the tumor group were positively correlated with pathological stage and differentiation（P<0.05）. There was a positive correlation between MGMT and EGFR expression in the tumor group（P<0.05）. Conclusion This study demonstrates that the expression of MGMT and EGFR is positively correlated to the pathological stage， differentiation in laryngeal squamous cell carcinoma. The high expression of MGMT and EGFR often means that the prognosis of the tumor is poor and it is more accurate in prognosis than the staging of the disease. The expression of MGMT and EGFR is worthy of clinical promotion as a biological indicator of LSCC.

[Key words] Laryngeal squamous cell carcinoma； Epidermal growth factor； MGMT； Prognosis； Immunohistochemical staining

喉鱗狀細(xì)胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是最常見的咽喉惡性腫瘤，也是頭頸部第二高發(fā)的細(xì)胞癌[1]，超過90%的咽喉惡性腫瘤為鱗狀細(xì)胞癌，而據(jù)調(diào)查顯示，該病在我國發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢。雖然喉鱗狀細(xì)胞癌被認(rèn)為與吸煙、飲酒及基因因素有關(guān)，但病因至今尚不明確[2]。但這并不影響喉鱗狀細(xì)胞癌對人體的極大危害，其早期癥狀為咽后部異物感，腫瘤惡化后可引起吞咽疼痛，后期則極易發(fā)生頸部淋巴結(jié)痛苦轉(zhuǎn)移并累及咽喉，導(dǎo)致呼吸困難[3]。隨著我國醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，手術(shù)與放療對早期喉鱗狀細(xì)胞癌的治療已取得較好效果，但該病致死率仍居高不下，這是由于患者自身健康意識不強(qiáng)以及喉鱗狀細(xì)胞癌的早期癥狀不夠明顯，導(dǎo)致確診時已發(fā)展為癌癥晚期，錯過了最佳治療時機(jī)[4]。因此尋找到能夠準(zhǔn)確判斷喉鱗狀細(xì)胞癌惡性程度的生物指標(biāo)是主要研究方向。腫瘤的形成與DNA的損傷密切相關(guān)，其中烷化劑對細(xì)胞威脅最大。O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT）是能高效修復(fù)細(xì)胞DNA損傷的酶，其在抵御烷化劑的過程中發(fā)揮了重要作用，因此對MGMT的研究是尋找喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后證據(jù)的方向之一[5]。表皮生長因子受體蛋白（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種廣泛分布于人體上皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面的糖蛋白，研究表明[6]許多實(shí)體腫瘤中存在EGFR的高表達(dá)，EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)，因此對EGFR表達(dá)的研究也是尋找喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后證據(jù)的方向。本次研究對喉鱗狀細(xì)胞癌中的MGMT及EGFR進(jìn)行檢測，旨在探討兩者的表達(dá)及其預(yù)后與喉鱗狀細(xì)胞癌惡性程度的關(guān)系，找到早期診斷喉鱗狀細(xì)胞癌更為有效的生物指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

標(biāo)本均選取2016年1月～2017年6月于我院耳鼻喉科手術(shù)治療的93例LSCC患者的石蠟切片，經(jīng)病理學(xué)確診為LSCC標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～65歲，性別不限；②患者臨床資料完整，被檢測的腫瘤標(biāo)本均為石蠟包埋組織；③遵守醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則，經(jīng)與患者和家屬溝通，其自愿簽訂知情同意書；④術(shù)前6個月內(nèi)未經(jīng)放、化療及免疫治療。

將LSCC患者設(shè)為腫瘤組，18～50歲40例，51～65歲53例；男63例，女30例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，未轉(zhuǎn)移53例；參照2015年世界衛(wèi)生組織（World health organization，WHO）腫瘤組織學(xué)分類[5]，將LSCC患者分為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期，其中Ⅰ期13例，Ⅱ期23例，Ⅲ期34例，Ⅳ期23例；參照腫瘤組織學(xué)，將腫瘤分化程度分為低、中和高三類，其中低分化24例，中分化36例，高分化33例；按浸潤程度將LSCC患者分為未及全層和浸潤全層兩類，其中未及全層41例，浸潤全層52例。另選取20例健康狀態(tài)的喉黏膜標(biāo)本作為對照組。

1.2 試劑盒

MGMT、EGFR多克隆抗體、二抗和DAB顯色試劑盒均購買自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 免疫組化染色

腫瘤組標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，常規(guī)2 μm連續(xù)切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；之后用蒸餾水沖洗，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）浸泡5 min；水浴高溫抗原修復(fù)；將切片自然冷卻至室溫，畫圈，滴加5%PSA（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，勿洗，滴加MGMT 1：90、EGFR 1：90的一抗工作液，37℃孵育1～2 h；PBS洗5 min，3次；滴加MGMT 1：100、EGFR 1：100的生物素標(biāo)記二抗，室溫靜置30 min；PBS洗5 min，3次；使用現(xiàn)配的DAB顯色液（B：C=1：50）顯色10 min；自來水充分沖洗，Mayer蘇木素復(fù)染30 s，鹽酸酒精分化3 s，自來水充分沖洗，脫水，乙酸2 min，乙醇梯度由低至高各2 min，二甲苯5 min，中性樹膠封片。

1.4 免疫組化結(jié)果分析

MGMT蛋白正常染色結(jié)果為鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性呈深淺不一的棕色，EGFR蛋白正常染色結(jié)果為鏡下細(xì)胞膜呈藍(lán)色，陽性呈深淺不一的棕色。按照陽性著色細(xì)胞評分法，隨機(jī)選取10個不同視野，在×400倍光學(xué)顯微鏡下按著色程度：0分無著色，1分淡黃色，2分淺棕色，3分深棕色。陽性范圍：1分<20%，2分20%～50%，3分51%～75%，4分>75%，二者相乘的積≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.5 觀察指標(biāo)

比較兩組喉部組織標(biāo)本MGMT的陽性檢出率，比較兩組喉部組織標(biāo)本EGFR的陽性檢出率，并進(jìn)一步比較腫瘤組喉部組織標(biāo)本MGMT與EGFR的陽性率和臨床資料的關(guān)系。陽性檢出率=檢出陽性例數(shù)/本組總例數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計學(xué)資料都采用SPSS21.0專業(yè)統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有的組間正態(tài)性計數(shù)資料以[n（%）]表示，用χ2檢驗(yàn)，連續(xù)變量的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 兩組MGMT與EGFR表達(dá)比較

腫瘤組與對照組MGMT表達(dá)水平比較，腫瘤組呈陽性表達(dá)的例數(shù)明顯高于對照組（P<0.05）；腫瘤組與對照組中EGFR表達(dá)水平比較，腫瘤組呈陽性表達(dá)的例數(shù)明顯高于對照組（P<0.05）。見表2。

2.2腫瘤組MGMT與EGFR表達(dá)水平和臨床一般資料間的關(guān)系

腫瘤組MGMT與EGFR的表達(dá)水平經(jīng)比較，在年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和浸潤程度方面，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而在分化程度方面，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且分化程度越高，與表達(dá)水平的關(guān)系越密切（P<0.05）。見表3。

2.3腫瘤組MGMT與EGFR間的相關(guān)性分析

腫瘤組在MGMT陽性表達(dá)的例數(shù)中，EGFR表達(dá)為陽性的概率為92.308%，MGMT陰性表達(dá)的例數(shù)中，EGFR表達(dá)為陰性的概率為64.286%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），對所有樣本MGMT與EGFR相關(guān)性分析得出，腫瘤組MGMT與EGFR呈正相關(guān)（r=0.105、0.243，P<0.05）。

3 討論

喉鱗狀細(xì)胞癌的病因雖尚不清楚，因此提高診斷的準(zhǔn)確性與預(yù)后的靈敏性，在治療LSCC中具有重要地位[7]。研究表明[8]，通過對早期喉鱗狀細(xì)胞癌患者進(jìn)行放、化療或手術(shù)治療，均使患者病情得到明顯改善，因此除了醫(yī)療技術(shù)的改善來提高治療LSCC的成功率外，通過提高對早期LSCC的診斷準(zhǔn)確率以及得到靈敏性高的預(yù)后指標(biāo)也是重要研究方向。在傳統(tǒng)的診斷與預(yù)后方法中，主要以間接喉鏡檢查咽喉部位有無腫瘤病變癥狀[9]，在疑似病變時配合CT檢查確定腫瘤范圍，效果并不是很理想，而預(yù)后也多以單一炎癥因子或腫瘤壞死相關(guān)因子作為指標(biāo)，由于干擾因素多所以靈敏性不高。而以MGMT與EGFR作為生物指標(biāo)，在檢查出疑似病變或常規(guī)體檢中，即可更準(zhǔn)確的確診病情，找到更明確的治療預(yù)后，制訂出對應(yīng)的治療方式[10]。

癌癥形成的重要步驟即為烷化劑對DNA分子的烷基化，導(dǎo)致DNA配對錯位而封閉DNA復(fù)制[11]。MGMT可以通過消耗酶而在突變發(fā)生以前把烷化基因轉(zhuǎn)移到自身，使DNA損傷得到修復(fù)[12]。本次研究結(jié)果顯示，腫瘤組的MGMT表達(dá)水平明顯高于對照組，且與病理分期和分化程度呈正相關(guān)關(guān)系，可能是因?yàn)?，對照組為正常喉部黏膜組織標(biāo)本，細(xì)胞DNA沒有發(fā)生大量烷基化突變，因此不能觸發(fā)MGMT的生成信號，而腫瘤組DNA分子烷基化損傷嚴(yán)重，MGMT作為自殺蛋白在將烷基化轉(zhuǎn)移自身后，啟動子區(qū)域甲基化，使其表達(dá)沉默[13]。這種內(nèi)部信號，誘導(dǎo)了ada基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，產(chǎn)生新的MGMT，以補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)因消耗而顯不足的MGMT[14]。而且根據(jù)對MGMT表達(dá)的研究，其在宮頸癌、食管癌、肺癌等不同模式中呈現(xiàn)不同模式，而根據(jù)病變部位喉部，癌癥中只有可能是屬于吼鱗癌膠質(zhì)瘤的高表達(dá)[15]。這也可能是出自機(jī)體自我保護(hù)意識為了應(yīng)對腫瘤的形成而釋放的信號，確切的MGMT生成機(jī)制尚不十分清楚[16]。EGFR在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，是細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體，而腫瘤在細(xì)胞增殖上表現(xiàn)的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，因此EGFR的突變或過表達(dá)往往會引發(fā)腫瘤[17]。本次研究結(jié)果顯示，腫瘤組的EGFR表達(dá)水平明顯高于對照組，且與病理分期和分化程度呈正相關(guān)關(guān)系。這可能是因?yàn)镋GFR的高表達(dá)主要與其基因擴(kuò)增有關(guān)，引起下游信號傳導(dǎo)增強(qiáng)[18]。而EGFR的信號傳導(dǎo)具有多重調(diào)節(jié)作用，加之EGFR受體某些結(jié)構(gòu)域的缺失使得受體下調(diào)機(jī)制的破壞，導(dǎo)致EGFR持續(xù)活化，EGFR的配體通過自分泌形式激活EGFR促進(jìn)細(xì)胞增殖[19]，他們的共表達(dá)往往預(yù)示腫瘤預(yù)后不良。而與病理分期、分化程度的正相關(guān)則是因?yàn)?，EGFR還與血管生成有關(guān)，EGFR促進(jìn)血管生成，為腫瘤的增殖分化提供了充足的生物組織環(huán)境，因此在分期高的病例中，血管密集度往往較高，EGFR表達(dá)水平自然更高[20]。因?yàn)槟[瘤形成的復(fù)雜性，在因EGFR高表達(dá)引起的腫瘤形成，接著產(chǎn)生的MGMT的高表達(dá)，間接證明二者的正相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，本次研究證明喉鱗狀細(xì)胞癌中MGMT、EGFR的表達(dá)與病理分期和分化程度呈正相關(guān)關(guān)系，MGMT、EGFR的高表達(dá)往往意味著腫瘤預(yù)后不良且比通過疾病分期更為準(zhǔn)確。MGMT、EGFR的表達(dá)作為LSCC的生物指標(biāo)值得臨床推廣。

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（收稿日期：2018-04-21）