五子衍宗方及其拆方對(duì)大鼠糖尿病性勃起功能障礙、生精細(xì)胞凋亡及NO-cGMP通路的影響※

曹 圣，熱增才旦，李永平，吳 萍，童 麗，包天佑

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

五子衍宗方出自明代張時(shí)徹撰寫的《攝生眾妙方》[1]，方由菟絲子、枸杞子、車前子、覆盆子、五味子五味藥組成，具有補(bǔ)腎益精的功效。其在臨床上常用來治療精液異常、少弱精子的男性不育[2]，但鮮有五子衍宗方治療糖尿病性勃起功能障礙的研究。為了探討五子衍宗方治療糖尿病性勃起功能障礙的療效及機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用DM(糖尿病)性ED(勃起功能障礙)大鼠模型，以五子衍宗方及其拆方為干預(yù)措施，對(duì)五子衍宗方是否會(huì)影響生精細(xì)胞凋亡及NO-cGMP通路而改善DM性ED大鼠的生殖及勃起功能進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

2月齡雄性SD大鼠100只(均有正常的性功能，交配試驗(yàn)證實(shí))，體重200±20 g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。按隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常對(duì)照組、模型組、澀精組(拆方I號(hào))、補(bǔ)腎組(拆方II號(hào))及全方組(五子衍宗方干預(yù)組)，每組10只。

1.2 藥物選擇

五子衍宗方干預(yù)組處方：菟絲子40 g，枸杞子40 g，覆盆子20 g，五味子5 g，車前子10 g；拆方I號(hào)處方：覆盆子20 g，五味子5 g；拆方II號(hào)處方：菟絲子40 g， 枸杞子40 g，車前子10 g。藥材均購(gòu)自青海省中醫(yī)院，由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系鑒定為正品。全方及拆方按比例稱重、混合，煎煮之前浸泡30 min，然后分別煎煮兩次，每次2 h，合并煎液，濾過，濾液分別減壓濃縮至0.108、0.023、0.085 g/mL，保存(4℃)備用。

1.3 主要試劑與儀器選擇

鏈脲佐菌素(STZ)，Sigma公司生產(chǎn)；阿樸嗎啡(APO)，Sigma公司生產(chǎn)；OneTouch SelectSimple血糖儀，上海強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；一氧化氮合酶(NOS)測(cè)定試劑盒、蛋白定量測(cè)試盒(雙縮脲法)，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；大鼠(Rat)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)ELISA檢測(cè)試劑盒，北京博奧拓達(dá)科技有限公司生產(chǎn)；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司生產(chǎn)；RT-6500酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司生產(chǎn)；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；RM6240生物信號(hào)采集系統(tǒng)，成都儀器廠生產(chǎn)。

1.4 DM性ED大鼠模型的建立及分組

1.4.1 DM大鼠模型的建立

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)選出10只作為正常對(duì)照組，其余大鼠禁食24 h，稱重，按40 mg/kg于左下腹腔內(nèi)注射STZ溶液(將STZ在冰浴中溶于pH4.0、濃度0.1mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，配置成濃度為10mg/mL的STZ溶液)。72 h后取尾靜脈血測(cè)血糖，血糖值>16.7 mmol/L者視作造模成功。

1.4.2 DM性ED大鼠模型的建立及分組

APO勃起試驗(yàn)：自注射STZ溶液2 w后，將DM大鼠放在觀察箱中適應(yīng)環(huán)境10 min，調(diào)暗室內(nèi)燈光，僅夠觀察即可，保持安靜，之后在每只大鼠頸項(xiàng)松弛皮膚處注射APO溶液(APO 5mg，維生素C 250mg，生理鹽水500mL，APO濃度為10μg/mL)100 μg/kg，立即觀察30 min，記錄陰莖有無勃起及勃起次數(shù)。大鼠龜頭充血及暴露末端陰莖體為陰莖勃起一次，未見勃起者為DM性ED模型大鼠。將成模大鼠隨機(jī)分為澀精組、補(bǔ)腎組以及全方組。

1.5 實(shí)驗(yàn)

正常對(duì)照組及模型組均灌服等體積的蒸餾水；澀精組灌服拆方I號(hào)藥液[0.23g/(kg·d)]，補(bǔ)腎組灌服拆方II號(hào)藥液[0.85g/(kg·d)]，全方組灌服五子衍宗方藥液[1.08g/(kg·d)] ；各組每天灌服1次，連續(xù)30 d。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 陰莖勃起功能檢測(cè)

治療30 d后，用10%的水合氯醛(0.2mL/100g)對(duì)大鼠行腹腔注射麻醉，固定，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，將22 G針頭(充滿250U/mL的肝素溶液)穿刺頸總動(dòng)脈并連接壓力檢測(cè)系統(tǒng)，記錄平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)。暴露下腹正中切口，游離海綿體神經(jīng)，剪開覆蓋在陰莖根部的皮膚暴露雙側(cè)陰莖腳，然后分離陰莖根部，用預(yù)充滿肝素溶液的22 G針頭插入左側(cè)陰莖海綿體，針頭另一端連接壓力檢測(cè)系統(tǒng)，再將壓力檢測(cè)系統(tǒng)上的雙鉤銀絲電極勾住一側(cè)海綿體神經(jīng)，刺激參數(shù)：5 ms，15 Hz，5 V。持續(xù)單刺激，刺激持續(xù)時(shí)間1 min，間隔5 min，重復(fù)3次，取平均值，記錄陰莖海綿體內(nèi)壓(intracavernosal pressure，ICP)。

1.6.2 生精細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

大鼠麻醉后用頸椎脫臼法處死，取一側(cè)睪丸速入4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片(5μm)，按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作檢測(cè)。以細(xì)胞核呈棕黃色為TUNEL染色陽性。參照Yin[3]的方法在顯微鏡(×100)下任選10個(gè)視野計(jì)數(shù)10個(gè)生精小管中的總細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出生精細(xì)胞凋亡指數(shù)(生精細(xì)胞凋亡指數(shù)AI=生精細(xì)胞凋亡數(shù)/總生精細(xì)胞數(shù))。

1.6.3 一氧化氮合酶(NOS)的檢測(cè)

1.6.4 環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)的檢測(cè)

取上述勻漿后獲得的上清液10 μL按照大鼠(Rat)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)ELISA檢測(cè)試劑盒說明書操作測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠ICP、MAP、ICP/MAP對(duì)比結(jié)果

結(jié)果顯示MAP在各組無明顯差異(P>0.05)，澀精組、補(bǔ)腎組、全方組ICP、ICP/MAP明顯高于模型組(P<0.01)，但均低于正常組(P<0.01)；補(bǔ)腎組ICP、ICP/MAP要明顯高于澀精組(P<0.01)，全方組要明顯高于補(bǔ)腎組(P<0.01)。澀精組、補(bǔ)腎組與全方組勃起功能明顯恢復(fù)，見表1。

2.2 TUNEL染色結(jié)果

正常對(duì)照組生精細(xì)胞凋亡較少，主要為精原細(xì)胞。模型組生精小管內(nèi)生精細(xì)胞大量減少，且可見嚴(yán)重的生精細(xì)胞凋亡，各級(jí)生精細(xì)胞均可見凋亡細(xì)胞，部分生精小管僅剩一層精原細(xì)胞。澀精組、補(bǔ)腎組及全方組生精細(xì)胞較模型組明顯增多，但澀精組TUNEL陽性細(xì)胞主要為精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞以及精子細(xì)胞，補(bǔ)腎組主要為精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，而全方組則主要為精原細(xì)胞，見圖1。

Table 1 Comparison of ICP，MAP and ICP/MAP among various

*：與模型組比較，P<0.01；#：與正常組比較，P<0.01；△：與澀精組比較，P<0.01；▲：與補(bǔ)腎組比較，P<0.01.

圖1 TUNEL法檢測(cè)生精細(xì)胞凋亡圖(×400，箭頭所指為TUNEL陽性細(xì)胞)

各組大鼠生精細(xì)胞凋亡指數(shù)結(jié)果顯示，治療后澀精組、補(bǔ)腎組、全方組生精細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于模型組(P<0.01)，但仍高于正常對(duì)照組(P<0.01)，全方組要低于澀精組及補(bǔ)腎組(P<0.01)，而澀精組與補(bǔ)腎組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

Table 2 Comparison of AI among various

*：與模型組比較，P<0.01；#：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；△：與澀精組比較，P<0.01.

2.3 各組大鼠總NOS、iNOS(誘導(dǎo)型NOS)、cNOS(結(jié)構(gòu)型NOS)、cGMP(環(huán)磷酸鳥苷)比較結(jié)果

結(jié)果顯示治療后澀精組、補(bǔ)腎組、全方組總NOS、iNOS、cNOS、cGMP與模型組相比均顯著增高(P<0.05)，但仍低于正常對(duì)照組(P<0.05)。其中，補(bǔ)腎組總NOS、iNOS、cNOS、cGMP又要高于澀精組(P<0.05)，全方組又要高于補(bǔ)腎組(P<0.05)，見表3。

組別n總NOS(U/mgprot)iNOS(U/mgprot)cNOS(U/mgprot) cGMP(nmol/L)正常組100.87±0.110.50±0.080.44±0.08 7.87±1.18模型組100.25±0.11#0.14±0.05#0.11±0.04#2.95±1.02#澀精組100.42±0.12*#0.24±0.06*#0.19±0.10*#4.59±1.21*#補(bǔ)腎組100.60±0.15*#△0.31±0.06*#△0.27±0.09*#△5.72±1.10*#△全方組100.75±0.11*#△▲0.39±0.07*#△▲0.36±0.08*#△▲6.80±1.30*#△▲F 42.657 41.467 26.779 26.987P 0.000 0.000 0.000 0.000

*：與模型組比較，P<0.05；#：與正常組比較，P<0.05；△：與澀精組比較，P<0.05；▲：與補(bǔ)腎組比較，P<0.05.

3 討論

3.1 五子衍宗方治療糖尿病性勃起功能障礙的中醫(yī)理論

糖尿病屬中醫(yī)中消渴范疇，消渴日久，耗氣傷陰，致腎虛精虧，而陰又損及陽，致腎陽虛衰，氣滯血瘀，陽舉不能，即致陽痿。五子衍宗方由菟絲子、枸杞子、車前子、覆盆子、五味子五子組成，凡子皆堅(jiān)實(shí)，多能補(bǔ)中，況有酸收之力，自能補(bǔ)五臟之陰而益精氣，凡子皆重，多能益腎[4]；菟絲子、枸杞子為君藥，補(bǔ)腎壯陽，覆盆子、五味子為臣藥，益腎澀精，車前子利水通淋，五藥相配，補(bǔ)腎益精之功更甚。用五子衍宗方治療糖尿病性勃起功能障礙是利用其補(bǔ)腎陰、健腎陽、行氣活血，符合糖尿病性勃起功能障礙陰陽兩虛、氣滯血瘀病機(jī)。

3.2 五子衍宗方及其拆方對(duì)糖尿病性勃起功能障礙生精細(xì)胞凋亡的影響

生精細(xì)胞凋亡在精子發(fā)生的過程中起著重要的作用，主要體現(xiàn)在4個(gè)方面：(1)它能保持生殖細(xì)胞與支持細(xì)胞的最佳比率。每個(gè)支持細(xì)胞僅能供有限的生殖細(xì)胞發(fā)展成精子，故而超過合適數(shù)量的精原細(xì)胞可能就會(huì)發(fā)生凋亡而維持最佳的比例[5]。(2)通過凋亡能清除異常生殖細(xì)胞，特別是染色體異常的生殖細(xì)胞[6]。(3)支持細(xì)胞之間緊密連接形成血睪屏障需要清除過度的生殖細(xì)胞，通過抑制凋亡誘導(dǎo)基因bax的表達(dá)來抑制生殖細(xì)胞凋亡，而阻止了支持細(xì)胞緊密連接的形成[7]。(4)在哺乳動(dòng)物接近青春期時(shí)，生殖細(xì)胞會(huì)發(fā)生大量凋亡，而抑制這種凋亡過程時(shí)，將會(huì)伴隨大量異常精子的產(chǎn)生而導(dǎo)致不孕[8]。糖尿病使睪丸組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病變，生精細(xì)胞大量死亡，精子嚴(yán)重減少，生精細(xì)胞凋亡增多。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，澀精組、補(bǔ)腎組、全方組的凋亡指數(shù)雖然仍高于正常對(duì)照組，但明顯低于模型組，且睪丸生精小管的病變明顯改善，以全方組最為明顯。其中，全方組的凋亡指數(shù)又低于澀精組與補(bǔ)腎組，而澀精組與補(bǔ)腎組的凋亡指數(shù)則無明顯差異?？梢姡遄友茏诜郊捌洳鸱骄芤种粕?xì)胞的凋亡，且均能對(duì)睪丸組織起到一定的恢復(fù)作用，而五子衍宗方拆方I、II組的功效不如五子衍宗方全方。

3.3 五子衍宗方及其拆方對(duì)糖尿病性勃起功能障礙NO-cGMP通路的影響

NOS催化人體內(nèi)L-精氨酸產(chǎn)生的NO在陰莖勃起過程中是最為重要的一種介質(zhì)[9]。NO擴(kuò)散入陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)，活化可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)，將三磷酸鳥苷(GTP)催化為cGMP，cGMP又通過蛋白激酶G途徑使細(xì)胞內(nèi)的Ca+濃度減小，導(dǎo)致陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞舒張，海綿體血流量增多，從而引起陰莖勃起[10-11]。糖尿病能夠使cGMP生成減少，弱化NO-cGMP通路對(duì)陰莖勃起的影響，從而影響勃起功能[12-13]。ICP測(cè)定是判斷陰莖勃起功能的金標(biāo)準(zhǔn)[14]，而ICP/MAP能夠減少外周循環(huán)血壓的影響，提高準(zhǔn)確性[15]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)各組大鼠的ICP、ICP/MAP得出澀精組、補(bǔ)腎組、全方組大鼠的勃起功能明顯恢復(fù)，其中補(bǔ)腎組的勃起功能要好于澀精組，而全方組的勃起功能要好于補(bǔ)腎組。澀精組、補(bǔ)腎組、全方組的總NOS、iNOS、cNOS活力、cGMP含量均明顯高于模型組。其中，補(bǔ)腎組的總NOS、iNOS、cNOS活力、cGMP含量要高于澀精組，而全方組要高于補(bǔ)腎組?？梢?，澀精組、補(bǔ)腎組、全方組能提高NOS活力使NO生成增多，cGMP含量也相應(yīng)增加，從而通過NO-cGMP通路改善勃起功能。

綜上所述，五子衍宗方及其拆方能通過改善睪丸組織病變、減少生精細(xì)胞凋亡而改善DM性ED大鼠的睪丸生殖功能。五子衍宗方及其拆方能通過提高總NOS、iNOS、cNOS活力、cGMP含量而改善DM性ED大鼠的勃起功能。