持續(xù)性低氧大鼠肝臟HIF-2α信號通路變化及對血糖的影響※

龔俊艷，趙成玉

(1.青海大學研究生院，西寧 810016；2.青海大學附屬醫(yī)院老年病科，西寧 810001)

大量的研究認為，高海拔居民的血糖水平及2型糖尿病的患病率低于海平面居民[1-2]。本研究擬通過對比常氧和低氧條件下大鼠血糖的變化，探討其可能的作用機制，為高原糖代謝異?；颊叩闹委熖峁┧悸?。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

50%葡萄糖注射液購于湖南科倫制藥有限公司，HIF-2α(ab199)購于Abcam公司，Akt(#9272)、P-Akt(#4060，Ser473)、Gsk-3β(#9315)、P-Gsk-3β(#9322，Ser9)購于Cell Signaling Technology公司，beta Actin(20536-1-AP)和抗兔辣根過氧化物酶抗體(SA00001-2)購于proteintech公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒和高效RIPA裂解液、Cocktail蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、2x蛋白上樣緩沖液購于北京索萊寶公司。RNA提取試劑盒、RNA反轉錄試劑盒及RNA定量試劑盒均購于TAKARA公司。血糖試紙條及血糖儀購于強生公司。

32只6～8 w雄性Wistar大鼠(200～220g)購于湖北省疾病預防控制中心[許可證號：SCXK(鄂)2015-0018]。飼養(yǎng)條件：普食，自由飲水，溫度22 ℃，濕度45%～75%。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗分組：32只雄性Wistar大鼠隨機分為常氧組(n=16)和低氧組(n=16)，常氧組在海拔200 m左右的常氧環(huán)境下飼養(yǎng)，低氧組在模擬海拔5 000 m的低壓氧艙中飼養(yǎng)。在實驗的第1 w和4 w各取8只，禁食12 h后(不禁水)行經腹腔注射葡萄糖耐量試驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)，評估大鼠糖耐量狀態(tài)。于次日晨，麻醉處死大鼠，留取肝臟進行Western Blot檢測，分析HIF-2α、Akt、P-Akt、Gsk-3β、P-Gsk-3β變化，同時進行qRT-PCR檢測，分析PEPCK、G6PC mRNA的變化。

1.2.2 大鼠空腹血糖及糖耐量評估：在實驗的第1 w和4 w各取8只，禁食12 h后(不禁水)，斷尾取血測空腹血糖(A)，繼而經腹腔注射50%葡萄糖(2g葡萄糖/kg體重)[3]，于注射葡萄糖后15 min、30 min(B)、60 min(C)、120 min(D)經大鼠尾靜脈采用強生穩(wěn)豪型血糖儀測血糖，用于評估大鼠糖耐量狀態(tài)。計算IPGTT血糖曲線下面積(Areas under the curve of glucose，AUCG)，AUCG(mmol/h·L)=1/4A+1/2B+3/4C+1/2D[3]。

1.2.4 qRT-PCR法檢測肝臟中糖異生相關酶的表達：按照試劑盒所示方法從肝臟組織中提取總RNA，并以此為模板反轉錄為cDNA，應用Primer5.0軟件設計各基因特異引物。引物序列：

G6PC 上游引物5′-AACGTCTGTCTGTCCCGGATCTA -3 ′，

下游引物5′-CCTCTGGAGGCTGGCATTGTA-3′；

PEPCK上游引物5′-CAGCCAATGTCCCATTATTGACC-3′，

下游引物5′-TGCCAGCTGAGAGCTTCGTAGA-3′；

β-actin上游引物5′- GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，

下游引物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG -3′。

以上引物均由TAKARA公司合成。按照實時熒光定量PCR試劑盒所示說明書，檢測各組G6PC mRNA、PEPCK mRNA的表達情況。PCR反應體系為25 μL，反應條件：SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 8.5 μL。

95 ℃ 30 sec，95 ℃ 5 sec、60 ℃ 30 sec(40個循環(huán))。每個樣本做3個重復孔。各組檢測結果采用2-△△Ct法分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠體重、空腹血糖及糖耐量評估

常氧組和低氧組大鼠隨著飼養(yǎng)時間的延長，大鼠體重增加，但是低氧組大鼠體重增加明顯少于常氧組(P<0.001，表1)。常氧組大鼠隨著飼養(yǎng)時間的延長血糖逐漸升高，但沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05，表1)；而低氧組大鼠隨著低氧時間的延長空腹血糖明顯降低(P<0.001，表2)和IPGTT血糖曲線下面積明顯減少(P<0.001，表1和表2)。與常氧組相比，低氧1 w和4 w大鼠IPGTT血糖曲線下面積明顯小于同期常氧組(P<0.001，表1)。

Table 1 Comparison of Weight and AUCG between the normoxia and hypoxia

※：樣本量=8

Table 2 Comparison of Fasting Blood Glucose between the normoxia and hypoxia

2.2 Western Blot法檢測肝臟相關蛋白的表達

與常氧組相比，低氧組大鼠HIF-2α蛋白表達量明顯升高(P<0.05，圖1和表3)，且隨著低氧時間的延長逐漸升高(P<0.05，圖1和表3) 。與常氧組相比，Akt、Gsk-3β、P-Akt和P-Gsk-3β蛋白表達量無明顯差異(P>0.05，圖2和表4)。

Table 3 Comparison of HIF-2α protein expression between the normoxia and hypoxia

組別例數(shù)P-Akt/Akt1 w4 wP-Gsk-3β/Gsk-3β1 w4 w常氧30.576±0.0230.564±0.0260.740±0.0290.705±0.040低氧30.601±0.0320.524±0.0230.738±0.0150.680±0.060t -1.106 1.932 0.117 0.590P 0.331 0.126 0.912 0.587

2.3 qRT-PCR法檢測大鼠PEPCK mRNA和G6PC mRNA表達

與常氧1 w比較，常氧4 w大鼠PEPCK mRNA和G6PC mRNA表達量明顯增加(P<0.05，表5)；與低氧1 w比較，低氧4 w PEPCK mRNA、G6PC mRNA表達量明顯降低(P<0.05，表5)。與常氧1 w比較，低氧組1 w PEPCK mRNA無差異(P>0.05，表5)、G6PC mRNA表達減少(P<0.05，表5)；與常氧4 w比較，低氧4 w PEPCK mRNA、G6PC mRNA表達量明顯減少(P<0.05，表5)。

Table 5 Comparison of G6PC mRNA and PEPCK mRNA between the normoxia and hypoxia

3 討論

本研究結果顯示，相比于常氧組大鼠，低氧組大鼠空腹血糖及IPGTT血糖曲線下面積明顯減少，與文獻報道的研究結果一致[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，低氧可增強細胞內葡萄糖攝取、糖酵解，同時增加與HIF-1表達相關的糖原合成[4]，減少與HIF-2的表達增加有關的肝臟糖異生[5]。

人類對于高原低氧環(huán)境的適應有一定的遺傳基礎，其中HIFs是多細胞動物對低氧應激的主要轉錄調節(jié)因子[6]。HIFs包括HIF-1與HIF-2，均由一個不同的α亞單位和相同的β亞單位構成的異源二聚體，其中α亞單位是功能亞單位，β亞單位是結構亞單位，但是它們的功能并不完全相同。HIF-1α主要參與急性低氧反應的應答，而HIF-2α主要在慢性低氧中發(fā)揮作用[7]。HIF-1α在能量調節(jié)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)中的作用已得到深入的研究，然而，對于HIF-2α對血糖的影響研究較少，目前研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α在內皮細胞、肝細胞、胰腺間質細胞、腎成纖維細胞及心肌細胞中都有表達[8]。研究發(fā)現(xiàn)通過基因沉默的方法抑制脯氨酸羥化酶的活性，使HIF-2α的表達增加，使大鼠血糖下降[9-10]。肝臟HIF-2α的激活，通過直接和間接作用誘導IRS-2表達，增強胰島素的信號[11]，促進糖原合成，抑制糖異生，降低血糖。

我們的研究結果顯示，與常氧組比較，低氧組大鼠HIF-2α蛋白表達量明顯升高，這與Taniguchi等的研究結果一致[9-10]，說明低氧促進HIF-2α蛋白的表達。HIF-2α參與機體葡萄糖代謝的機制，目前認為是低氧觸發(fā)肝臟HIF-2α/IRS-2軸，通過直接和間接作用誘導IRS-2，依次激活Akt、FOXO1、Gsk-3β和mTOR[9]，放大肝臟胰島素信號通路[12]。但是我們的研究發(fā)現(xiàn)，P-Akt/Akt比值在兩組之間無統(tǒng)計學差異，這與Gamboa研究結果一致[1]，但與Wei 等研究結果相反[9-10，13]，這可能與基礎情況下Akt并未被激活有關。Gamboa的研究提示在胰島素刺激條件下，低氧組P-Akt比值顯著高于常氧組[1]。Akt是一種絲氨酸/酪氨酸激酶，需要胰島素刺激胰島素受體底物蛋白在胰島素受體部位聚集才能被激活[11]。我們主要是在基礎水平研究了Akt的活化狀態(tài)，而沒有在胰島素刺激條件下進行研究，這可能是P-Akt/Akt比值在兩組之間無統(tǒng)計學差異的原因。Akt重要的底物有Gsk-3β和FOXO1[14]。Gsk-3β通過使糖原合成酶磷酸化而抑制其活性，導致糖原合成減少。因此，Akt能通過磷酸化抑制Gsk-3β的活性，增加糖原合成酶的活性，促進細胞攝取葡萄糖并合成糖原，降低血糖[14]。P-Gsk-3β/Gsk-3β比值在兩組之間無明顯統(tǒng)計學差異，可能在低氧環(huán)境下大鼠肝臟對血糖的調節(jié)過程中糖原合成途徑不占據(jù)主導地位。FOXO1 作為胰島素信號通路的一個靶分子，被Akt磷酸化后出核失活，從而解除其對糖異生基因G6PC及PEPCK的轉錄調控作用，抑制肝臟的葡萄糖異生，從而降低血糖。我們對肝臟糖異生關鍵酶的表達進行了測定，與常氧組相比，低氧組大鼠G6PC mRNA表達量1 w和4 w都是明顯降低的(P<0.05)，PEPCK mRNA表達量于4 w時明顯降低，這與Dera的研究結果一致[13]，PEPCK和G6PC都是糖異生的限速酶，二者表達量降低，說明糖異生過程受到抑制，血糖生成減少。

我們的研究尚存在不足，首先我們只研究了基礎條件下Akt、Gsk-3β的活化狀態(tài)，而沒有研究胰島素刺激條件下的變化；其次我們沒有檢測糖原合成酶及糖原含量的變化，故無法說明低氧條件下，HIF-2α到底是主要通過抑制糖異生還是通過抑制糖原合成途徑而使機體血糖降低。

綜上所述，我們的研究最主要的發(fā)現(xiàn)是，低氧條件下大鼠血糖是降低的，HIF-2α蛋白表達量是升高的，并與低氧時間相關，在低氧第4 w時糖異生關鍵酶G6PC和PEPCK mRNA明顯降低，可能是通過抑制糖異生途徑使機體血糖降低。