多孔氧化鋅對(duì)斷奶仔豬糞便中微量元素含量、盲腸內(nèi)容物與糞便中短鏈脂肪酸含量及腸道菌群多樣性的影響

彭 鵬 陳思佳 蔣再慧 湯小朋 李成良 鄧 敦 羅 杰 王躍麗 印遇龍,,3 方熱軍*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長沙410128；2.唐人神集團(tuán)股份有限公司院士工作站，株洲412002；3.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙410125)

現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中，仔豬斷奶時(shí)間一般為18～28日齡，斷奶行為給仔豬在生活及環(huán)境方面帶來了很大的變化并容易引起腹瀉，導(dǎo)致仔豬生長受阻甚至死亡，給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來較大損失。研究表明，飼糧中添加藥理劑量氧化鋅(3 000 mg/kg左右)可以顯著降低斷奶仔豬腹瀉率[1-3]，增加采食量并提高日增重[4-5]。但長期添加藥理劑量氧化鋅反過來又會(huì)影響斷奶仔豬生長發(fā)育，藥理劑量氧化鋅降低仔豬腹瀉促進(jìn)生長的這種優(yōu)勢只能維持到斷奶后3周，超過3周氧化鋅毒性的負(fù)面作用就會(huì)顯現(xiàn)出來[6-7]。并且，氧化鋅的利用率很低，大約有80%的氧化鋅從糞便中排出[8]，造成鋅源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。由于環(huán)保意識(shí)的不斷加強(qiáng)，可降低鋅排放的高利用率新型氧化鋅成為行業(yè)研究的熱點(diǎn)。新工藝生產(chǎn)的多孔氧化鋅，與普通氧化鋅相比具有更好的流動(dòng)性、更大的比表面積、更低的系酸力，可以有效降低斷奶仔豬腹瀉并促進(jìn)其生長[9-10]。有研究表明，腸道短鏈脂肪酸含量及微生物菌群與仔豬斷奶后腹瀉、腸道健康狀況有較大關(guān)系[11-12]，但目前關(guān)于多孔氧化鋅在這方面的研究報(bào)道較少。因此，本試驗(yàn)擬探討不同添加量的多孔氧化鋅對(duì)斷奶仔豬糞便微量元素排放、腸道短鏈脂肪酸含量及菌群多樣性的影響，旨在為多孔氧化鋅在仔豬飼糧中的應(yīng)用提供理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用多孔氧化鋅(鋅含量為75%)由法國Animine公司提供；普通氧化鋅(鋅含量為79%)由湖北博華農(nóng)牧科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)飼糧

按照體重相近的原則，選取192頭健康狀況良好的21日齡“杜×長×大”斷奶仔豬[平均體重(6.32±0.24) kg]，再按照體重相近原則分成4個(gè)組，分別為A組(正對(duì)照組，在基礎(chǔ)飼糧中添加3 000 mg/kg普通氧化鋅)、B組(負(fù)對(duì)照組，基礎(chǔ)飼糧)、C組(在基礎(chǔ)飼糧中添加750 mg/kg多孔氧化鋅)、D組(在基礎(chǔ)飼糧中添加1 500 mg/kg多孔氧化鋅)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8頭仔豬(公母各占1/2)，試驗(yàn)期14 d。試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2012)仔豬營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在唐人神集團(tuán)股份有限公司科研豬場進(jìn)行。試驗(yàn)豬在保育高床上飼養(yǎng)，飼糧為固體顆粒料，自由采食，自由飲水，按時(shí)打掃欄內(nèi)衛(wèi)生，定期消毒，按照常規(guī)程序進(jìn)行免疫。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供Premix provided the following for per kilogram of the diet：VA 550.00 IU，VD3400.00 IU，VE 50.00 IU，VK31.00 mg，VB12.50 mg，VB24.50 mg，VB63.50 mg，VB120.04 mg，泛酸 pantothenic acid 20.00 mg，煙酸 niacin 35.00 mg，生物素 biotin 0.10 mg，葉酸 folic acid 0.40 mg，膽堿 choline 500.00 mg，Cu(CuSO4·5H2O) 12.00 mg，F(xiàn)e (FeSO4) 110.00 mg，Zn (ZnSO4) 100.00 mg，Mn (MnSO4·H2O) 10.00 mg，I (KI) 0.40 mg，Se(Na2SeO3) 0.30 mg。

2)消化能及有效磷為計(jì)算值，其余營養(yǎng)水平均為實(shí)測值。DE and AP were calculated values, while the other nutrient levels were measured values.

1.4 樣品的采集

試驗(yàn)第13天16:00，每個(gè)重復(fù)選1頭仔豬，無菌收集直腸內(nèi)容物(糞便)，分為2份，分別放入10 mL凍存管并迅速放入液氮中保存，一份用于檢測微量元素含量，另一份用于檢測短鏈脂肪酸含量；試驗(yàn)第14天，每個(gè)重復(fù)屠宰1頭仔豬，無菌采集空腸中段與盲腸內(nèi)容物，分別放入5 mL凍存管并迅速置于液氮中。樣品采集完畢后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 飼糧中營養(yǎng)成分含量測定

飼糧中粗蛋白質(zhì)含量參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6432—1994進(jìn)行測定；賴氨酸含量參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18246—2000進(jìn)行測定；鈣含量參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6436—2002進(jìn)行測定。

1.5.2 糞便中微量元素含量測定

糞便中微量元素含量采用原子吸收光譜儀(Thermo Fisher ICE3500，美國)測定。測定前將新鮮糞樣在65 ℃烘干，粉碎，過40目篩，自封袋保存。準(zhǔn)確稱取1～2 g糞樣于坩堝中，然后在電爐上加熱至完全碳化，隨后轉(zhuǎn)到550 ℃馬弗爐中灼燒灰化4 h至無炭粒且呈灰白色，取出冷卻后加入10 mL濃硝酸，再次置于電爐加熱至微沸，微沸狀態(tài)持續(xù)5 min，趁熱過濾至100 mL容量瓶中，冷卻后定容，待測。

1.5.3 盲腸內(nèi)容物和糞便中短鏈脂肪酸含量測定

盲腸內(nèi)容物和糞便中短鏈脂肪酸含量的測定采用氣相色譜法(島津GC-2014ATF/SPL氣相色譜儀，日本)。準(zhǔn)確稱取1 g樣品，加4 mL超純水，振蕩混勻30 min后，15 000 r/min離心15 min將上清液轉(zhuǎn)移；重復(fù)以上步驟1次，合并上清液并定容到10 mL離心管中，取4.5 mL上清液，按9∶1體積比在樣品中加入25%偏磷酸，固定3 h以上。然后15 000 r/min離心10 min，45 μm濾膜過濾，加入上機(jī)瓶。

色譜條件：色譜柱選用DB-FFAP柱，規(guī)格30 mm×250 μm×0.25 μm；載氣為高純氮?dú)?，流?.8 mL/min，輔助氣為高純氫氣，火焰離子檢測器(FID)溫度280 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比50∶1，進(jìn)樣量1 μL；程序升溫，初始溫度60 ℃，以20 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持1 min。

1.5.4 腸道菌群多樣性分析

將樣品送至上海派森諾生物技術(shù)公司，使用高通量測序技術(shù)對(duì)空腸內(nèi)容物進(jìn)行16S rRNA基因測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007整理后，采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey’s法進(jìn)行組間多重比較，數(shù)據(jù)用平均值表示，用SEM反映組間樣本均值的離散程度、衡量樣本均值與總體均值離散程度。統(tǒng)計(jì)分析以P<0.05表示有差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 多孔氧化鋅對(duì)斷奶仔豬糞便中微量元素含量的影響

由表2可知，與添加3 000 mg/kg普通氧化鋅的A組相比，添加750 mg/kg多孔氧化鋅的C組、添加1 500 mg/kg多孔氧化鋅的D組及未添加氧化鋅的B組糞便中鋅含量顯著降低(P<0.05)；C組糞便中錳含量顯著高于A組、D組(P<0.05)，與B組差異不顯著(P>0.05)。各組糞便中銅、鐵含量差異不顯著(P>0.05)。

表2 多孔氧化鋅對(duì)斷奶仔豬糞便中微量元素含量的影響(風(fēng)干基礎(chǔ))

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無或相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 多孔氧化鋅對(duì)盲腸內(nèi)容物和糞便中短鏈脂肪酸含量的影響

由表3可知，與B組相比，A組、C組、D組盲腸內(nèi)容物中乙酸含量分別增加了33.58%、44.74%、39.79%(P<0.05)；C組和D組盲腸內(nèi)容物中丙酸含量顯著增加(P<0.05)，A組則無顯著變化(P>0.05)；A組、C組、D組盲腸內(nèi)容物中異丁酸、異戊酸和戊酸含量無顯著變化(P>0.05)。盲腸內(nèi)容物中各短鏈脂肪酸含量在A組、C組和D組之間均無顯著差異(P>0.05)。糞便中各短鏈脂肪酸含量在各組之間均無顯著差異(P>0.05)。

表3 多孔氧化鋅對(duì)斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物和糞便中短鏈脂肪酸含量的影響

2.3 多孔氧化鋅對(duì)斷奶仔豬腸道菌群多樣性的影響

2.3.1 菌群聚類分析

根據(jù)空腸內(nèi)容物樣品中的可操作分類單元(OTUs)，聚類分析結(jié)果將共有、特有的OTUs進(jìn)行分析并繪制了Venn圖，從圖1中可以看出，A組、B組、C組、D組共有的OTUs個(gè)數(shù)為771，其中A組特有的OTUs數(shù)為44，B組特有的OTUs數(shù)為272，C組特有的OTUs數(shù)為146，D組特有的OTUs數(shù)為169。

圖1 OTUs聚類分析結(jié)果

2.3.2 α多樣性分析

使用QIIME軟件，對(duì)OTUs豐度矩陣中每個(gè)樣本的序列按90%的相似度在不同深度下隨機(jī)抽樣，以每個(gè)深度下抽取的序列數(shù)及其對(duì)應(yīng)的OTUs數(shù)分別計(jì)算反映群落豐富度的Chao1、ACE指數(shù)及兼顧群落均勻性的Shannon和Simpson指數(shù)。從表4可以看出，與A組相比，B組、C組、D組的Chao1、ACE指數(shù)逐漸升高，雖然組間差異不顯著(P>0.05)，但在一定程度上也可以反映菌落豐富度在增加；B組的Shannon指數(shù)最高，為6.23，其次是C組、D組，分別為6.04和5.84，A組最低，為5.30，Simpson指數(shù)變化規(guī)律與Shannon指數(shù)類似，表明高劑量普通氧化鋅有抑制菌群豐富度與均勻度的趨勢，從而降低菌群多樣性。

2.3.3 腸道菌群門水平及屬水平分布

根據(jù)物種注釋結(jié)果，分別在門水平和屬水平選取了豐富度排名前20的物種進(jìn)行了分析，由圖2可知，在門水平上，仔豬空腸主要優(yōu)勢菌群包括厚壁菌門(Firmicutes)、變形桿菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、無壁菌門(Tenericutes)；C組與D組相比，隨著多孔氧化鋅添加量的增加，厚壁菌門相對(duì)豐度增加，變形桿菌門、放線菌門相對(duì)豐度降低。從整體來看，添加氧化鋅后對(duì)空腸的菌群結(jié)構(gòu)與均勻度有較大的影響。由圖3可知，在屬水平上，仔豬空腸主要優(yōu)勢菌群包括鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、羅斯氏菌屬(Rothia)和其他物種；與B組相比，A組、D組鏈球菌屬相對(duì)豐度增加，乳桿菌屬相對(duì)豐度降低，A組、C組羅氏菌屬相對(duì)豐度增加；另外，C組不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)相對(duì)豐度最高。

表4 α多樣性指數(shù)

Firmicutes：厚壁菌門；Proteobacteria：變形桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Tenericutes：無壁菌門；Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Acidobacteria：酸桿菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；Chloroflexi：綠屈撓菌門；Nitrospirae：硝化螺旋菌門；Gemmatimonadetes：芽單胞菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Planctomycetes：浮霉?fàn)罹T；Spirochaetes：螺旋體門；Chlamydiae：衣原體門；Elusimicrobia：迷蹤菌門；Others：其他。

圖2空腸菌群門水平分布

Fig.2 Bacterial distribution in jejunum at phylum level

3 討 論

3.1 多孔氧化鋅對(duì)斷奶仔豬糞便中微量元素含量的影響

研究表明，飼糧中鋅和銅、鐵存在著拮抗作用，即添加高鋅時(shí)會(huì)降低銅、鐵的吸收利用率，會(huì)使得糞便中銅、鐵的含量增加，這種拮抗作用可能是由于多個(gè)微量元素在裝運(yùn)過程中競爭共用轉(zhuǎn)運(yùn)載體產(chǎn)生的[13-16]。本試驗(yàn)結(jié)果中，相比于負(fù)對(duì)照組，添加3 000 mg/kg普通氧化鋅及750、1 500 mg/kg多孔氧化鋅并未對(duì)斷奶仔豬糞便中銅含量造成顯著影響，同時(shí)，也未顯著影響斷奶仔豬糞便中鐵含量，這與Carlson等[17]、王超[18]的研究結(jié)果一致。一般情況下，配制高劑量氧化鋅的飼糧時(shí)都會(huì)將銅、鐵添加量加大，以保證在拮抗作用下有足夠的銅、鐵被仔豬吸收而滿足其生長，這樣高劑量氧化鋅對(duì)銅、鐵的拮抗作用相對(duì)來說會(huì)減弱或者消除[8]。本研究結(jié)果還表明，與添加3 000 mg/kg普通氧化鋅相比，添加750和1 500 mg/kg多孔氧化鋅顯著降低了斷奶仔豬糞便中鋅含量。Wang等[19]研究表明，與飼糧中添加氧化鋅+硫酸黏桿菌混合物相比，添加1 200 mg/kg納米氧化鋅顯著降低糞便中鋅含量。申俊華等[20]研究了包被氧化鋅對(duì)糞便中鋅含量的影響，認(rèn)為可以使用低濃度氧化鋅替代高濃度普通氧化鋅，從而達(dá)到降低糞便中鋅含量，節(jié)約鋅源，減少污染環(huán)境，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。另外，本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，添加750 mg/kg多孔氧化鋅的C組糞便中錳含量顯著高于A組、D組，與B組差異不顯著，同時(shí)B組糞便中錳含量顯著高于添加1 500 mg/kg多孔氧化鋅的D組，飼糧中鋅水平對(duì)糞便中錳含量而言，似乎并沒有很強(qiáng)的相關(guān)性，這與徐書培[21]的研究結(jié)果基本一致。

Streptococcus：鏈球菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Rothia：羅斯氏菌屬；Gemella：孿生球菌屬；Acinetobacter：不動(dòng)桿菌屬；Ochrobactrum；蒼白桿菌屬；Corynebacterium：棒桿菌屬；Eubacterium：真桿菌屬；Collinsella：柯林斯氏菌屬；Burkholderia：伯克霍爾德氏菌屬；Facklamia：費(fèi)克藍(lán)姆氏菌屬；Catenibacterium：糞球菌屬；Achromobacter：無色桿菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；Aerococcus：氣球菌屬；Staphylococcus：葡萄球菌屬；Others：其他。

圖3空腸菌群屬水平分布

Fig.3 Bacterial distribution in jejunum at genus level

3.2 多孔氧化鋅對(duì)斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物及糞便中短鏈脂肪酸含量的影響

短鏈脂肪酸一般是指乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸，它們由腸道微生物通過厭氧發(fā)酵腸道中纖維和抗性淀粉而產(chǎn)生[22]。短鏈脂肪酸中，乙酸可迅速被腸上皮吸收進(jìn)入外周血液并為宿主供能[23]，丙酸經(jīng)上皮吸收后進(jìn)入肝臟，用于糖原合成[24]，丁酸是結(jié)腸上皮細(xì)胞的能源物質(zhì)，能促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞增值與發(fā)育[25]，腸道微生物也可以通過利用乳酸和丙酸轉(zhuǎn)化為丁酸。短鏈脂肪酸還可以降低腸道pH，促進(jìn)有益菌如比雙歧桿菌等的增殖，并抑制特定病原菌的定植[26-27]。因此，腸道短鏈脂肪酸含量的增加有益于腸道健康，有利于動(dòng)物生長。本研究結(jié)果顯示，與負(fù)對(duì)照組相比，添加3 000 mg/kg普通氧化鋅及750、1 500 mg/kg多孔氧化鋅使斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物中乙酸含量分別增加了33.58%、44.74%、39.79%，且添加750、1 500 mg/kg多孔氧化鋅還顯著提高了斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物中丙酸的含量；與添加3 000 mg/kg普通氧化鋅相比，添加750、1 500 mg/kg多孔氧化鋅對(duì)斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物中各短鏈脂肪酸含量均未產(chǎn)生顯著影響。低劑量氧化鋅組與高劑量氧化鋅組斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物中各短鏈脂肪酸含量無顯著差異的結(jié)果與Starke等[7]報(bào)道的結(jié)果相似，而與Janczyk等[28]報(bào)道的對(duì)仔豬飼喂高劑量氧化鋅飼糧4周后，造成了盲腸內(nèi)容物中丙酸和異丁酸含量顯著下降的結(jié)果不一致。其原因可能與飼喂高劑量氧化鋅飼糧時(shí)間長短相關(guān)，飼喂時(shí)間超過3周，鋅離子毒性累積，對(duì)仔豬負(fù)面作用凸顯[6-7]。

3.3 多孔氧化鋅對(duì)斷奶仔豬腸道菌群多樣性的影響

仔豬腸道內(nèi)的有益菌和有害菌是相互拮抗、相互依存的，以維持腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡。但斷奶應(yīng)激會(huì)破壞這種動(dòng)態(tài)平衡，有研究報(bào)道，仔豬產(chǎn)生斷奶應(yīng)激后，腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)容易失調(diào)[29]，導(dǎo)致仔豬腹瀉、飼料轉(zhuǎn)化率下降等問題出現(xiàn)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與未添加氧化鋅及添加750、1 500 mg/kg多孔氧化鋅相比，添加3 000 mg/kg普通氧化鋅后空腸菌群總OUTs數(shù)及特有OUTs數(shù)減少，Chao1、ACE、Shannon指數(shù)都有所下降，且Simpson指數(shù)有下降的趨勢，意味著高劑量普通氧化鋅在一定程度上會(huì)降低空腸菌群多樣性，不添加氧化鋅或添加低劑量氧化鋅有利于增加空腸菌群多樣性，這種現(xiàn)象可能與低鋅環(huán)境下細(xì)菌的生長調(diào)節(jié)相關(guān)，這與李治學(xué)[29]、呂航[30]對(duì)回腸菌群多樣性的研究結(jié)果一致。

有研究表明，高劑量氧化鋅顯著降低了仔豬回腸中羅伊斯乳酸桿菌、瑞士乳桿菌的比例，增加了魏氏菌、明串珠菌、鏈球菌的比例[31]；高劑量氧化鋅降低了35日齡仔豬空腸和回腸乳酸桿菌的數(shù)量，并降低了大腸桿菌的數(shù)量[7]；高劑量氧化鋅有降低盲腸乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量的趨勢[32]。這些結(jié)果說明高劑量氧化鋅對(duì)空腸、回腸及盲腸菌群多樣性的影響基本一致，空腸、回腸的菌群結(jié)構(gòu)很大程度上影響到了后腸菌群結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與未添加氧化鋅的負(fù)對(duì)照組相比，添加3 000 mg/kg普通氧化鋅和1 500 mg/kg多孔氧化鋅后空腸菌群中乳桿菌屬的相對(duì)豐度降低，鏈球菌屬的相對(duì)豐度增加，與前人研究結(jié)果一致，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加750和1 500 mg/kg多孔氧化鋅可以降低斷奶仔豬糞便中鋅含量，節(jié)約鋅資源并減少環(huán)境污染。

② 飼糧中添加多孔氧化鋅可以提高盲腸中短鏈脂肪酸含量，有利于豐富腸道菌群多樣性。