殼寡糖對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)性能、腸道組織結(jié)構(gòu)和非特異性免疫功能的影響

孫 飛 何 杰 葉元土* 蔡春芳 吳 萍 吳代武 周露陽(yáng) 高敏敏 郁 濃 張艷芳

(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州215123；2.中泰和(北京)科技發(fā)展有限公司，北京100027)

殼寡糖(chitosan oligosaccharides,COS)是首先由甲殼素(chitin)脫乙酰化生成分子質(zhì)量為幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)幾道爾頓、吸收率為1%～5%的殼聚糖(chitosan)，再經(jīng)生物酶解后得到的分子質(zhì)量<2 000 u、可被吸收進(jìn)入體內(nèi)的低聚糖，它由2～10個(gè)氨基葡萄糖通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成，是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基多糖。殼寡糖是一種具有水溶性好、生物活性高、易吸收等特點(diǎn)的低分子質(zhì)量的寡糖類產(chǎn)品[1]，與殼聚糖在分子質(zhì)量大小、水溶性和吸收性等方面有差異[2]。寡糖的結(jié)構(gòu)、乙酰度、純度以及溶解度的不同，會(huì)產(chǎn)生不同的作用效果。殼寡糖以添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物飼料中已經(jīng)有報(bào)道。蘇鵬等[3]報(bào)道，殼寡糖可促進(jìn)紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)的生長(zhǎng)，提高其非特異性免疫功能；田娟等[4]研究表明，殼寡糖能改善吉富羅非魚(yú)(GIFT，Oreochromisniloticus)的腸道組織結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)其腸道主要菌群結(jié)構(gòu)；還有研究表明，殼寡糖可以促進(jìn)斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)的生長(zhǎng)，提高機(jī)體的抗氧化能力和對(duì)氧化脅迫的抗性[5]。

本試驗(yàn)以異育銀鯽為試驗(yàn)對(duì)象，在基礎(chǔ)飼料中添加不同劑量的殼寡糖，來(lái)探討其對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)性能、腸道結(jié)構(gòu)、非特異性免疫指標(biāo)的影響，同時(shí)研究殼寡糖是否對(duì)由飼料中氧化油脂引起的副作用有緩解作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用殼寡糖由中泰和(北京)科技發(fā)展有限公司公司提供，是以水產(chǎn)動(dòng)物甲殼多糖為原料，采用酶法降解殼聚糖與膜分離耦合技術(shù)生產(chǎn)的一種吸收性寡糖，殼寡糖純度為10%，載體為麥芽糊精，脫乙酰度大于90%(2位氨基寡糖)，pH為7.0～9.0，殼寡糖分子質(zhì)量<2 000 u，溶于水。

1.2 試驗(yàn)飼料

配制基礎(chǔ)飼料所用原料由江蘇省大豐市華辰水產(chǎn)實(shí)業(yè)有限公司提供。試驗(yàn)用豆油為中糧公司生產(chǎn)的“福臨門(mén)”牌一級(jí)大豆油。氧化豆油制作過(guò)程：在正常豆油中添加七水合硫酸亞鐵30 mg/L、五水硫酸銅15 mg/L、30%的過(guò)氧化氫600 mg/L和0.3%的水，混合后，放在(80±2) ℃的水浴鍋中，每30 min充氧氣1 min(循環(huán))，制作過(guò)程共14 d。

首先配制油脂原料分別為正常豆油和氧化豆油的2種基礎(chǔ)飼料，然后在含有正常豆油和氧化豆油的基礎(chǔ)飼料中分別添加0、0.02%、0.04%和0.06%的殼寡糖，共配制8種試驗(yàn)飼料(CG、OO、CG-200、CG-400、CG-600、OO-200、OO-400、OO-600)，以油脂原料為正常豆油的未添加殼寡糖的飼料(CG)作為正對(duì)照組，以油脂原料為氧化豆油的未添加殼寡糖的飼料(OO)為負(fù)對(duì)照組。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。各組飼料水分、粗蛋白質(zhì)以及粗脂肪含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

飼料原料經(jīng)粉碎過(guò)60目篩，先將大料(比例>4%)置于混合機(jī)混勻10 min；再將混合小料與上述混合好的大料逐級(jí)稀釋混勻，置于混合機(jī)混勻10 min；最后將豆油(或氧化豆油)和添加的水(制粒需要)按逐級(jí)稀釋混勻的辦法與上述混合物混合(混合后過(guò)40目篩，顆粒物用粉碎機(jī)粉碎)，再置于混合機(jī)混勻20 min。混合好的飼料用小型環(huán)膜制粒機(jī)(溫度65 ℃)制成直徑1.5 mm，長(zhǎng)2～3 mm的顆粒狀飼料，晾至水分在13%左右后，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用前按需要量取出飼料自然解凍后投喂?/p>

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼料提供The premix provided the following per kg of diets：Cu (as copper sulfate) 5 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 180 mg，Mn (as manganese sulfate) 35 mg，Zn (as zinc sulfate) 120 mg，I (as potassium iodide) 0.65 mg，Se (as sodium selenite) 0.5 mg，Se (as cobalt selenite) 0.07 mg，Mg (as magnesium selenite) 300 mg，K (as potassium selenite) 80 mg，VA 10 mg，VB18 mg，VB28 mg，VB620 mg，VB120.1 mg，VC 250 mg，VD34 mg，VK36 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 20 mg，煙酸 nicotinic acid 25 mg，葉酸 folic acid 5 mg，肌醇 inositol 100 mg。

2)營(yíng)養(yǎng)水平均為實(shí)測(cè)值。Nutrient levels were all measured values.

1.3 試驗(yàn)魚(yú)與養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在江蘇省大豐市華辰水產(chǎn)實(shí)業(yè)有限公司華墾池塘網(wǎng)箱中進(jìn)行。在面積為40 m×60 m的池塘中設(shè)置24個(gè)試驗(yàn)網(wǎng)箱(規(guī)格為1.5 m×1.5 m×2.0 m)。為了保證池塘溶氧量均勻，池塘中間設(shè)置2臺(tái)葉輪式增氧機(jī)，同時(shí)設(shè)置1臺(tái)微孔增氧鼓風(fēng)機(jī)，每2個(gè)網(wǎng)箱之間放置1個(gè)納米曝氣管(直徑20 mm)制成的圓形微孔增氧盤(pán)，增氧盤(pán)直徑為0.5 m，安裝在水下1.8 m的深度，投喂期間關(guān)閉增氧設(shè)備，投喂前使用微孔增氧1 h，其余時(shí)間一直使用葉輪式增氧。

試驗(yàn)用異育銀鯽魚(yú)種購(gòu)自江蘇省大豐市華辰水產(chǎn)實(shí)業(yè)有限公司，運(yùn)輸前停食24 h。選取規(guī)格整齊的異育銀鯽960尾，平均體重為(7.60±0.05) g。將上述試驗(yàn)魚(yú)消毒后，隨機(jī)分成8組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)(網(wǎng)箱)，共計(jì)24個(gè)網(wǎng)箱，每個(gè)網(wǎng)箱40尾魚(yú)。將試驗(yàn)魚(yú)分配到試驗(yàn)網(wǎng)箱中暫養(yǎng)，用相應(yīng)對(duì)照組基礎(chǔ)飼料每天早、晚各過(guò)量投喂2次，以基礎(chǔ)飼料馴化適應(yīng)2周后開(kāi)始正式投喂。日投喂2次(06:00—8:30、17:00—19:30)，日投喂量為魚(yú)種體重的3%～5%，每10 d估算1次魚(yú)體增重，調(diào)整投喂量，正式投喂72 d。每天06:00、18:00測(cè)試、記錄水溫。每5 d測(cè)定1次水下30 cm處水質(zhì)。整個(gè)試驗(yàn)期間水溫22～36 ℃，溶解氧濃度>5.0 mg/L，pH 8.2～8.6，氨氮濃度<0.2 mg/L，亞硝酸鹽濃度<0.01 mg/L，硫化物濃度<0.05 mg/L。

1.4 樣品采集

正式養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，停食24 h，進(jìn)行采樣工作。

1.4.1 全魚(yú)采集

正式養(yǎng)殖試驗(yàn)開(kāi)始前，隨機(jī)抽取10尾異育銀鯽作為初始樣本，進(jìn)行全魚(yú)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，對(duì)每個(gè)網(wǎng)箱的魚(yú)稱重，統(tǒng)計(jì)數(shù)量，計(jì)算成活率、增重率、特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)，并在每個(gè)網(wǎng)箱中隨機(jī)抽取2尾魚(yú)為全魚(yú)留樣，進(jìn)行常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析。

1.4.2 血清采集

用1 mL無(wú)菌注射器尾柄靜脈采血，置于2 mL Eppenddorf管中自然凝固30 min后，離心(4 ℃，3 500 r/min)15 min后，每管血液取上層血清200 μL，混勻，分裝(每管200 μL)于0.5 mL Eppenddorf管中(每個(gè)網(wǎng)箱至少分裝12管血清)，液氮速凍之后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于分析血清非特異性免疫指標(biāo)。

1.4.3 組織切片樣品采集

每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)選取2尾魚(yú)，取長(zhǎng)度為1 cm左右的中腸，于滅菌的0.75%生理鹽水中洗凈后，置于10%甲醛中固定，用于制作組織切片。各組試驗(yàn)魚(yú)取樣的腸段位置保持一致。

1.5 樣品分析

1.5.1 常規(guī)指標(biāo)分析

樣品用冷凍干燥機(jī)干燥至恒重測(cè)其水分，之后用于其他指標(biāo)測(cè)定；粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量以及酸價(jià)、過(guò)氧化值和丙二醛含量(飼料和油脂)均采用國(guó)標(biāo)方法測(cè)定。

1.5.2 血清非特異性免疫指標(biāo)分析

血清超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性以及丙二醛含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，測(cè)定步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5.3 腸道組織切片

經(jīng)過(guò)甲醛固定的腸道組織經(jīng)洗滌、酒精梯度脫水、透明、透蠟、石蠟包埋后切片，切片厚5 μm，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腸道組織結(jié)構(gòu)，并采用NikonCOOL-PIX4500型相機(jī)進(jìn)行拍照，Smart-4500軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)量化處理，測(cè)量腸皺襞高度、腸皺襞寬度以及腸壁厚度。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間若有顯著差異，則進(jìn)行Duncan氏法多重比較，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 殼寡糖對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)性能的影響

經(jīng)72 d的池塘網(wǎng)箱養(yǎng)殖，得到各組異育銀鯽的生長(zhǎng)性能數(shù)據(jù)，具體見(jiàn)表2。各組異育鯽魚(yú)在試驗(yàn)期間均無(wú)死亡，成活率均為100.00%。與CG組相比，CG-200組的特定生長(zhǎng)率升高了16.20%，差異顯著(P<0.05)；CG-400、CG-600組的特定生長(zhǎng)率未發(fā)生顯著變化(P>0.05)；OO組的特定生長(zhǎng)率降低了8.10%，差異顯著(P<0.05)。與OO組相比，OO-200、OO-400、OO-600組的特定生長(zhǎng)率分別升高了5.36%、5.75%、4.21%，但差異均不顯著(P>0.05)。此外，OO-200、OO-400、OO-600組的特定生長(zhǎng)率與CG組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。CG-200組的增重率顯著高于其他各組(P<0.05)，其他各組間差異不顯著(P>0.05)。

對(duì)于飼料系數(shù)，CG-200組與CG組相比降低了6.33%，但差異不顯著(P>0.05)；CG-400、CG-600、OO組較CG組分別升高了28.58%、80.38%、17.72%，差異顯著(P<0.05)；OO-200、OO-400、OO-600組較OO組分別降低了6.45%、2.15%、9.14%，但差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 殼寡糖對(duì)異育銀鯽體成分的影響

由表3可知，殼寡糖添加量以及豆油是否氧化對(duì)全魚(yú)水分、粗蛋白質(zhì)以及粗脂肪含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.3 殼寡糖對(duì)異育銀鯽腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

將各組試驗(yàn)魚(yú)中腸同一位置的腸段做成組織切片，并通過(guò)顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1。與CG組相比，OO組腸皺襞高度減小，寬度增大，腸壁變薄；CG-200組腸道絨毛排列整齊，腸皺襞高度高，寬度?。籓O-400組較OO組腸皺襞高度變高,寬度減小，腸壁厚度增厚，達(dá)到CG組水平。

表2 殼寡糖對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)性能的影響

增重率=100×(Wt-W0)/W0；特定生長(zhǎng)率=100×(lnWt-lnW0)/t；飼料系數(shù)=Wf/(Wt-W0)。式中：Wt、W0分別表示終末均重、初始均重；Wf表示投喂飼料的總量。

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Weight gain rate=100×(Wt-W0)/W0; specific growth rate=100×(lnWt-lnW0)/t; feed conversion ratio=Wf/(Wt-W0). In the formula,WtandW0represented the final average body weight and the initial average body weight, respectively, andWfrepresented the total weight of the diet.

Values in the same row with different letter superscripts indicated significantly different (P<0.05). The same as below.

表3 殼寡糖對(duì)異育銀鯽體成分的影響

對(duì)顯微鏡所采集的圖片進(jìn)行測(cè)量，經(jīng)過(guò)Smart-4500軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)量化處理，得到各組異育銀鯽腸皺襞高度、腸皺襞寬度、腸壁厚度的數(shù)據(jù)化結(jié)果，分別見(jiàn)圖2、圖3和圖4。

由圖2可知，與CG組相比，CG-200組的腸皺襞高度增高了86.84%，差異顯著(P<0.05)；CG-400、CG-600、OO組的腸皺襞高度均降低，其中CG-600、OO組分別降低了15.08%、17.81%，差異顯著(P<0.05)。與OO組相比，OO-200、OO-400、OO-600組的腸皺襞高度分別增高了9.98%、18.89%、4.48%，其中OO-400組與OO組的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。此外，OO-200、OO-400組的腸皺襞高度與CG組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。由圖3可知，對(duì)于腸皺襞寬度，與CG組相比，CG-200、CG-400組均減小，但差異均不顯著(P>0.05)，但CG-600、OO組分別增大了47.38%、70.37%，差異顯著(P<0.05)；與OO組相比，OO-200、OO-400、OO-600組分別降低了36.65%、42.99%、33.72%，差異顯著(P<0.05)；此外，OO-200、OO-400、OO-600組與CG組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。由圖4可知，各組腸壁厚度的變化趨勢(shì)與腸皺襞高度的變化趨勢(shì)基本一致。

1～8分別表示CG、OO、CG-200、CG-400、CG-600、OO-200、OO-400和OO-600組異育銀鯽的腸道組織切片。T代表腸壁厚度，H代表腸皺襞高度，W代表腸皺襞寬度。

1 to 8 represented the intestinal sections of crucian carp (Carassiusauratusgibelio) of CG, OO, CG-200, CG-400, CG-600, OO-200, OO-400 and OO-600 groups, respectively. T represented the thickness of intestinal wall, H represented the height of intestinal fold, and W represented the width of intestinal fold.

圖1異育銀鯽腸道組織切片

Fig.1 Intestinal tissue sections of crucian carp (Carassiusauratusgibelio)

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Date columns with different letters indicated significantly different (P<0.05). The same as below.

圖2殼寡糖對(duì)異育銀鯽腸皺襞高度的影響

Fig.2 Effects of COS on intestinal fold height of crucian carp (Carassiusauratusgibelio) (n=6)

2.4 殼寡糖對(duì)異育銀鯽血清非特異性免疫指標(biāo)的影響

由圖5可知，與CG組相比，CG-200、CG-400、CG-600組血清超氧化物歧化酶活性均有所上升，但差異均未達(dá)顯著水平(P>0.05)，其中CG-200組上升最高，上升了6.59%；OO組則下降了27.35%，差異顯著(P<0.05)。與OO組相比，OO-200、OO-400、OO-600組血清超氧化物歧化酶活性分別上升了26.25%、40.90%、18.15%，差異顯著(P<0.05)，其中OO-400組與CG組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。對(duì)于血清丙二醛含量，與CG組相比，CG-200、CG-600組下降，CG-400組上升，但差異均不顯著(P>0.05)，但OO組上升了25.72%，差異顯著(P<0.05)。與OO組相比，OO-200、OO-400、OO-600組血清丙二醛含量分別下降了12.98%、16.20%、27.53%，但差異均不顯著(P>0.05)，且OO-200、OO-400、OO-600組血清丙二醛含量與CG組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)。血清過(guò)氧化氫酶活性各組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖3 殼寡糖對(duì)異育銀鯽腸皺襞寬度的影響

圖4 殼寡糖對(duì)異育銀鯽腸壁厚度的影響

圖5 殼寡糖對(duì)異育銀鯽血清非特異性免疫指標(biāo)的影響

3 討 論

本試驗(yàn)條件下，以CG組為對(duì)照，在含4%豆油的飼料(常規(guī)飼料)中添加0.02%殼寡糖使異育銀鯽的特定生長(zhǎng)率升高了16.20%，并且飼料系數(shù)降低了6.33%；但飼料中添加0.04%、0.06%殼寡糖時(shí)異育銀鯽的特定生長(zhǎng)率未產(chǎn)生顯著變化；氧化豆油替代豆油使異育銀鯽的特定生長(zhǎng)率下降了8.10%，飼料系數(shù)增加了17.72%。以O(shè)O組為對(duì)照，在含4%氧化豆油的飼料中添加0.04%殼寡糖可以使異育銀鯽的特定生長(zhǎng)率升高了5.75%，飼料系數(shù)下降了2.15%，使異育銀鯽生長(zhǎng)速度和飼料系數(shù)恢復(fù)到飼喂常規(guī)飼料異育銀鯽的水平。

殼寡糖的生物活性取決于自身的物理化學(xué)性質(zhì)，如脫乙酰度、電荷分布以及化學(xué)修飾[15]。殼寡糖主要通過(guò)以下途徑對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能產(chǎn)生影響：1)促進(jìn)礦物元素的吸收。殼寡糖分子上含有氨基(—NH2)和羥基(—OH)等活性基團(tuán)，很容易與礦物元素結(jié)合后在小腸被吸收[16]。2)改善腸道結(jié)構(gòu)。研究表明，飼料中添加適量殼寡糖后，腸道絨毛變高、變細(xì)，同時(shí)可以增加絨毛密度，使絨毛與食物接觸面積更大，促進(jìn)腸道對(duì)食物的消化與吸收[17]。

對(duì)腸道黏膜組織結(jié)構(gòu)的改善是殼寡糖的一個(gè)重要的作用位點(diǎn)。魚(yú)類的腸道是消化與吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所，也是魚(yú)類最大的黏膜免疫器官，腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的正常是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和腸道免疫正常的基礎(chǔ)[18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在常規(guī)飼料中殼寡糖添加量為0.02%時(shí)，異育銀鯽腸道絨毛排列整齊均勻，與CG組相比，其腸皺襞高度增加了86.84%，腸壁厚度增加了20.45%，腸皺襞寬度減少了12.18%，腸道結(jié)構(gòu)改善效果最好；氧化豆油使異育銀鯽腸道結(jié)構(gòu)遭到損害，腸皺襞高度減少了17.81%，腸皺襞寬度增大了70.37%，腸壁厚度減少了30.33%；在氧化豆油飼料中添加0.04%殼寡糖時(shí)，與OO組相比，其腸皺襞高度增加了18.89%，腸皺襞寬度減少了2.98%，腸壁厚度增加了38.35%，有效地改善了飼料中氧化油脂帶來(lái)的負(fù)作用，使魚(yú)體腸道結(jié)構(gòu)達(dá)到飼喂常規(guī)飼料水平。這表明，飼料中添加適量殼寡糖可以有效地改善腸道結(jié)構(gòu)，增大絨毛與食物的接觸面積，促進(jìn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。Dimitroglou等[19]在飼料中添加適量的甘露寡糖使金頭鯛(Sparusaurata)腸道皺襞高度、密度都有一定增加；Pryor等[20]在飼料中添加適量甘露寡糖同樣使墨西哥灣鱘的腸道皺襞高度、密度增加，這與本研究結(jié)果相似。

殼寡糖對(duì)腸道結(jié)構(gòu)的改善主要可能是在于殼寡糖能抑制病原菌在腸道黏膜上的定植，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞增殖，有利于動(dòng)物消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)正常發(fā)育，其作用途徑有2個(gè)：1)殼寡糖具有高親和力的配體，能提供與細(xì)菌外源凝集素特異性吻合的結(jié)合位點(diǎn)，從而阻斷病原菌與腸黏膜上皮細(xì)胞結(jié)合[21]；2)殼寡糖能促進(jìn)有益菌的增殖，使其能更廣泛地附著在腸壁表面，從而減少有害菌與腸壁的接觸[22]。也有研究表明，殼寡糖對(duì)腸道內(nèi)環(huán)境改善的同時(shí)，也有利于魚(yú)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。殼寡糖本身可以作為促生長(zhǎng)因子被有益菌所利用，并能產(chǎn)生B族維生素，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，提高魚(yú)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[23]。本研究還發(fā)現(xiàn)，飼料中添加殼寡糖后，異育銀鯽腸壁厚度增加，這與劉愛(ài)軍君[22]的觀點(diǎn)不一致，劉愛(ài)君等[22]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加殼寡糖后奧尼羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus×O.aureus)腸壁厚度減少，這可能與養(yǎng)殖動(dòng)物的種類、地區(qū)、時(shí)間以及水體等不同有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究。

殼寡糖作為一類水溶性的、容易吸收的2-氨基寡糖，可能被魚(yú)體吸收并在抗氧化損傷、維護(hù)免疫防御系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能完整等方面發(fā)揮生理作用，提升魚(yú)體的免疫防御能力。魚(yú)類是較低等的脊椎動(dòng)物，非特異性免疫是魚(yú)類主要的免疫系統(tǒng)。血清中超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性以及丙二醛含量是衡量魚(yú)類非特異性免疫的重要指標(biāo)。超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其主要功能是清除自由基；過(guò)氧化氫酶是機(jī)體生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，其主要功能是清除體內(nèi)的過(guò)氧化氫，使機(jī)體免受過(guò)氧化氫的毒害；丙二醛是生物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的氧化終產(chǎn)物，脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)引起細(xì)胞損傷，因此血液中丙二醛的含量可以間接地反映機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的損傷程度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在常規(guī)飼料中添加0.02%殼寡糖后，以CG組為對(duì)照，血清超氧化物歧化酶活性上升了6.59%，丙二醛含量下降了16.94%；氧化豆油使血清超氧化物歧化酶活性下降了27.35%，丙二醛含量上升了25.72%；以O(shè)O組為對(duì)照，在含氧化豆油的飼料中添加0.04%殼寡糖后，血清超氧化物歧化酶活性上升了40.90%，丙二醛含量下降了16.20%，異育銀鯽血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量達(dá)到了飼喂常規(guī)飼料異育銀鯽的水平。殼寡糖提升魚(yú)類的非特異性免疫能力可能從以下方面來(lái)實(shí)現(xiàn)：1)殼寡糖具有清除羥自由基(·OH)的能力，從而提升魚(yú)體的抗氧化能力，保護(hù)免疫器官，進(jìn)而增強(qiáng)免疫功能[23]。2)殼寡糖可促進(jìn)有益菌如雙歧桿菌等的大量增殖，而雙歧桿菌可以提高機(jī)體的抗體水平，激活巨噬細(xì)胞的吞噬活性，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[24]。

在異育銀鯽常規(guī)飼料中添加殼寡糖并非添加量越大效果越好，CG-400和CG-600組特定生長(zhǎng)率相對(duì)于CG-200組顯著降低，可能的原因有：1)飼料中添加的殼寡糖在魚(yú)體腸道內(nèi)不被消化，直接被腸道上皮細(xì)胞吸收，進(jìn)入血液循環(huán)，與體內(nèi)各種基團(tuán)結(jié)合發(fā)揮其多種功能。隨著殼寡糖添加量的增加，魚(yú)體本身不能通過(guò)調(diào)節(jié)作用減少對(duì)殼寡糖的吸收，雖然增加量不多，但可能殼寡糖會(huì)在血液循環(huán)中與其他基團(tuán)結(jié)合過(guò)度，導(dǎo)致內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡。2)飼料添加適量殼寡糖會(huì)增加魚(yú)體的免疫能力，但隨著殼寡糖添加量的增加，可能會(huì)使魚(yú)體產(chǎn)生免疫抑制，影響魚(yú)體免疫系統(tǒng)。

飼料中的氧化油脂對(duì)異育銀鯽的生長(zhǎng)有負(fù)面影響，飼料中補(bǔ)充殼寡糖可以一定程度地修復(fù)這類負(fù)面影響。飼料中油脂氧化后產(chǎn)生的氧化油脂會(huì)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能以及腸道健康等造成損害，主要原因有以下幾點(diǎn)：1)氧化油脂會(huì)導(dǎo)致飼料適口性下降，降低攝食量[25]；2)氧化油脂所含有的初級(jí)和次級(jí)氧化產(chǎn)物，如過(guò)氧化物、丙二醛等，會(huì)打破機(jī)體自由基代謝平衡，使自由基異常增加，破壞抗氧化酶活性，導(dǎo)致魚(yú)類產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷[26]；3)氧化油脂會(huì)導(dǎo)致虹鱒(Oncorhynchusmykiss)胃腸無(wú)食物，出現(xiàn)積水[27]，草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)攝食含氧化油脂的飼料后腸道緊密連接結(jié)構(gòu)打開(kāi)，腸道通透性變大[28]。殼寡糖豐富的生物活性如抗氧化作用等可能是其促進(jìn)異育銀鯽生長(zhǎng)同時(shí)緩解由氧化豆油引起的負(fù)面影響的主要原因。本試驗(yàn)所用殼寡糖分子質(zhì)量<2 000 u，脫乙酰度>90%。Feng等[29]比較了不同分子質(zhì)量的水溶性殼寡糖的抗氧化能力，結(jié)果顯示分子質(zhì)量越小其抗氧化能力越強(qiáng)，這可能是受分子間氫鍵的影響。高分子質(zhì)量的殼聚糖結(jié)構(gòu)緊湊，分子內(nèi)氫鍵強(qiáng)，殼聚糖的抗氧化能力受其影響較大。低分子質(zhì)量的殼聚糖結(jié)構(gòu)較松散，分子內(nèi)氫鍵弱，殼聚糖的抗氧化能力受其影響較小。此外，低分子質(zhì)量的殼聚糖比高分子質(zhì)量的殼聚糖擁有更多的自由羥基和氨基，其清除超氧陰離子自由基的能力明顯高于高分子質(zhì)量的殼聚糖。Je等[30]研究了不同脫乙酰度的殼寡糖清除自由基的能力，發(fā)現(xiàn)殼寡糖清除自由基的能力強(qiáng)弱取決于殼寡糖的脫乙酰度程度，結(jié)果顯示脫乙酰程度最大的殼寡糖有最好的清除自由基的能力，這可能是由于殼寡糖能夠提供正電子與自由基反應(yīng)，將自由基轉(zhuǎn)變成了更穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。以上研究結(jié)果表明本試驗(yàn)所用殼寡糖具有較強(qiáng)的抗氧化性，殼寡糖可通過(guò)提升異育銀鯽的抗氧化能力，在一定程度上改善由氧化豆油帶來(lái)的魚(yú)體損傷。

4 結(jié) 論

① 在含4%豆油的常規(guī)飼料中添加0.02%的殼寡糖可以促進(jìn)異育銀鯽生長(zhǎng)，并維護(hù)魚(yú)體健康。

② 氧化豆油會(huì)對(duì)異育鯽魚(yú)的生長(zhǎng)和健康造成負(fù)面影響，在該飼料中添加0.04%的殼寡糖可改善由氧化豆油引起的負(fù)面影響，使異育銀鯽的健康程度達(dá)到飼喂常規(guī)飼料異育銀鯽的水平。