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      牛膝多糖抑制沙門氏菌侵染豬小腸上皮細(xì)胞的研究

      2018-12-13 06:01:32趙玉蓉王耀東
      關(guān)鍵詞:培養(yǎng)箱沙門氏菌侵染

      趙玉蓉 王耀東

      (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心,長沙410128)

      腸黏膜屏障可有效地阻擋腸道內(nèi)微生物及其毒素向腸腔外組織擴(kuò)散和病原微生物的入侵[1-2],而其黏膜上皮細(xì)胞間良好的緊密連接結(jié)構(gòu)是維持腸黏膜發(fā)揮正常屏障功能和吸收功能的前提[3]。研究表明,緊密連接是依靠一系列跨膜及外周蛋白相互作用形成的復(fù)合體,包括跨膜的閉鎖蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudin)和細(xì)胞質(zhì)密閉小帶(ZO)1~3等多種蛋白[4-5],一旦這些蛋白的表達(dá)和定位發(fā)生改變,就會(huì)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞骨架重排、連接結(jié)構(gòu)破壞,從而導(dǎo)致細(xì)胞通透性升高,對(duì)抗原物質(zhì)的屏障功能減弱,病原體將通過上皮細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體,引發(fā)一系列腸道疾病[6-9]。沙門氏菌是一種革蘭氏陰性菌,可以通過誘導(dǎo)吞噬作用侵入腸上皮細(xì)胞并在含沙門氏菌液泡中存活和繁殖[10],在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中,極易感染2~4月齡的仔豬,導(dǎo)致仔豬腹瀉,甚至死亡[11]。庾慶華[6]研究表明,沙門氏菌SL1344和SARB21感染人結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)后,occludin、claudin-1、ZO-1等蛋白表達(dá)下降,分布分散,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞輪廓不清晰。牛膝多糖(Achyranthesbidentatapolysaccharides,ABPS)是從莧科植物牛膝中提取、分離、純化得到的一種生物活性多糖,具有抗氧化、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等系列作用[12]。陳清華[13]研究表明,飼糧中添加適量的ABPS能顯著抑制腸道病原菌生長,顯著降低仔豬腹瀉發(fā)生率,但這是否與ABPS參與調(diào)控腸上皮細(xì)胞間緊密連接的形成有關(guān)目前鮮有報(bào)道。因此,本試驗(yàn)旨在以豬小腸上皮細(xì)胞(intestinal porcine epithelial cells-1,IPEC-1)為研究對(duì)象,人為感染沙門氏菌,探討ABPS處理對(duì)沙門氏菌侵染IPEC-1的影響,以期為仔豬的健康養(yǎng)殖以及ABPS的開發(fā)利用提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 主要材料

      IPEC-1、沙門氏菌817菌株均由德州農(nóng)工大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。

      ABPS購自武漢東康源科技有限公司,純度99%。

      1.2 主要試劑及配制

      DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、雙抗試劑購自Hyclone公司;胎牛血清(FBS)、細(xì)胞凍存液購自Gibco公司;D-Hank’s緩沖液、中性磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Biotopped公司;Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)和SYBR Premix EX TaqTMⅡ(RR820A)試劑盒均購自寶生物(大連)工程有限公司;表皮生長因子(EGF)、ITS liquid Media Supplement(100 ×)購自Sigma公司。

      100 mg/mL ABPS母液:稱取ABPS粉末0.500 g,溶于5 mL三蒸水中,0.22 μm微孔濾膜抽濾器抽濾除菌,分裝,-20 ℃保存。

      LB液體培養(yǎng)基:分別稱取10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl,加入950 mL雙蒸水中溶解,用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0,定容至1 L,121 ℃、20 min高壓滅菌,4 ℃儲(chǔ)存。

      LB固體培養(yǎng)基:分別稱取10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl,加入950 mL雙蒸水中溶解,用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0,定容至1 L,然后加入15 g瓊脂粉,121 ℃、20 min高壓滅菌,待冷卻至50~60 ℃時(shí),倒制平板。

      基礎(chǔ)培養(yǎng)基:95% DMEM/F12培養(yǎng)基+5% FBS+5 μg/L EGF+1‰ ITS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素。

      5 mg/mL噻唑藍(lán)(MTT):稱取0.5 g MTT,溶于100 mL PBS中,0.22 μm微孔濾膜抽濾器抽濾除菌,4 ℃避光保存。

      1.3 主要方法

      1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

      IPEC-1經(jīng)活化后,培養(yǎng)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至80%~90%融合后,用0.25%胰蛋白酶消化,倒置顯微鏡下計(jì)數(shù),收集細(xì)胞用于細(xì)胞傳代或后續(xù)試驗(yàn)。

      1.3.2 ABPS對(duì)IPEC-1增殖的影響

      將細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,分別加入相應(yīng)劑量的ABPS,使培養(yǎng)基中ABPS終濃度分別為0(對(duì)照)、50、100、200、400 μg/mL,分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每個(gè)處理設(shè)6個(gè)重復(fù)孔),加入20 μL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄培養(yǎng)基,加150 μL 二甲基亞砜(DMSO),搖床低速振蕩10 min,用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測吸光度值(OD值)。細(xì)胞增殖以O(shè)D值呈現(xiàn)。

      1.3.3 沙門氏菌對(duì)IPEC-1的侵染

      沙門氏菌的準(zhǔn)備:細(xì)胞消化分板當(dāng)天,挑取單個(gè)817菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,200 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)過夜(10~12 h),然后取10 μL菌液于另1支5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫箱培養(yǎng)(20~24 h),1 000 r/min離心10 min,棄上清,用5 mL不含抗生素和FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)菌。

      將細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔加入1 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,待細(xì)胞貼壁后,分別加入相應(yīng)劑量的ABPS,使培養(yǎng)基中ABPS終濃度分別為0(對(duì)照)、50、100、200、400 μg/mL(每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)孔),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,吸棄培養(yǎng)基,PBS潤洗2次;每孔加入100 μL沙門氏菌懸液,1 000 r/min室溫離心10 min,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h;吸棄上清液,PBS潤洗2次;每孔加入含慶大霉素(100 μg/mL)無FBS的培養(yǎng)基1 mL,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h;吸棄培養(yǎng)基,PBS潤洗3次;每孔加入200 μL 1% Triton X-100裂解液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育5 min;每孔加入800 μL PBS,反復(fù)吹打,然后移入1.5 mL離心管,用PBS按10倍次方依次稀釋。

      每個(gè)LB培養(yǎng)皿(內(nèi)徑9 cm)中分別接種100 μL的上述裂解稀釋液(10-3、10-4、10-5,每個(gè)稀釋液重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿),用滅菌棒涂抹均勻,待菌液完全吸收后,倒置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18~24 h。

      菌落數(shù)的計(jì)數(shù)(CFU/皿):用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。

      1.3.4 ABPS對(duì)IPEC-1緊密連接蛋白相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

      將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入2 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,待細(xì)胞貼壁后,分別加入相應(yīng)劑量的ABPS,根據(jù)1.3.3侵染結(jié)果,本試驗(yàn)培養(yǎng)基中ABPS終濃度分別為0(對(duì)照)、50、200 μg/mL(每個(gè)處理設(shè)5個(gè)重復(fù)孔),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,吸棄培養(yǎng)基,PBS潤洗2次;每孔加入1 mL Trizol,按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA。

      cDNA合成:按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser操作說明書進(jìn)行,反應(yīng)結(jié)束后-20 ℃保存?zhèn)溆谩R锞缮虾Iど镉邢薰竞铣?,具體信息見表1。

      表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

      實(shí)時(shí)熒光定量PCR:采用SYBR GreenⅠ染料法,按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ操作說明書在CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為:10 μL SYBR Premix EX Taq Ⅱ,2 μL稀釋后的cDNA模板,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,雙蒸水6.4 μL,反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 40 s,35個(gè)循環(huán);熔解曲線從60至95 ℃逐步升溫(每5 s增加0.5 ℃)獲得。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參,采用2-△△Ct法進(jìn)行目的基因的相對(duì)表達(dá)量計(jì)算。

      1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

      數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后,用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),之后采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,差異顯著水平為P<0.05,極顯著水平為P<0.01,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 ABPS對(duì)IPEC-1增殖的影響

      由表2可知,用不同濃度ABPS分別處理IPEC-1細(xì)胞12、24、48、72 h后檢測細(xì)胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)時(shí)間條件下各組間IPEC-1細(xì)胞活性均無顯著性差異(P>0.05)。

      2.2 ABPS對(duì)沙門氏菌侵染IPEC-1的影響

      由表3可知,用不同濃度的ABPS處理IPEC-1細(xì)胞48 h,然后接種沙門氏菌,發(fā)現(xiàn)各組間細(xì)胞被侵染的沙門氏菌數(shù)量差異極顯著(P<0.01)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明,ABPS顯著抑制沙門氏菌侵染IPEC-1,其抑制效果呈先增加后下降的趨勢。培養(yǎng)基中添加50 μg/mL ABPS抑制沙門氏菌侵染IPEC-1的效果最強(qiáng),極顯著高于對(duì)照組和200、400 μg/mL ABPS組(P<0.01),與100 μg/mL ABPS組的差異不顯著(P>0.05)。

      2.3 ABPS對(duì)IPEC-1緊密連接相關(guān)蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

      由表4可知,不同組間IPEC-1緊密連接相關(guān)蛋白R(shí)AC1、ZO-1、occludin、claudin-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均存在極顯著差異(P<0.01)。與對(duì)照組相比,0、200 μg/mL ABPS均顯著上調(diào)RAC1、ZO-1、occludin和claudin-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。其中,RAC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別增加77%、48%;ZO-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別增加79%、64%;occludin mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別增加125%、81%;claudin-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別增加218%、140%。與50 μg/mL ABPS組相比,200 μg/mL ABPS組的RAC1、occludin和claudin-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。

      表2 ABPS對(duì)IPEC-1增殖的影響

      同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05),不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同

      In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

      表3 ABPS對(duì)沙門氏菌侵染IPEC-1的影響

      表4 ABPS對(duì)IPEC-1緊密連接相關(guān)蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

      3 討 論

      大量研究表明,ABPS對(duì)腸道功能有改善作用,并且可以改善免疫系統(tǒng)。秦文雅[14]研究表明,ABPS可以改善LPS應(yīng)激對(duì)腸道吸收功能以及免疫功能的影響。李孟偉[15]研究表明,細(xì)胞培養(yǎng)基中添加300~1 200 μg/mL的APBS能夠顯著地促進(jìn)豬腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)的增殖,并且適宜的ABPS對(duì)IPEC-J2生長有一定的保護(hù)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,ABPS對(duì)IPEC-1的增殖無顯著影響。

      沙門氏菌是一種革蘭氏陰性菌,通常在動(dòng)物腸道內(nèi)感染,也會(huì)通過污染食物引起人類食物中毒。在各類細(xì)菌引起的食物中毒中,沙門氏菌中毒是最為常見的疾病之一[16]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中,由于仔豬的腸道功能發(fā)育不完善、免疫能力低下,沙門氏菌極易感染2~4月齡的仔豬,致使仔豬體溫升高、精神不振、長時(shí)間發(fā)生腹瀉、生長發(fā)育緩慢、停滯等,嚴(yán)重時(shí)發(fā)生敗血癥,最終導(dǎo)致仔豬死亡[11,17]。本研究結(jié)果表明,ABPS預(yù)處理的IPEC-1能顯著抵抗沙門氏菌的侵染,此現(xiàn)象與陳清華[13]、馬杰等[18]的報(bào)道相似,即飼糧中添加適量的ABPS能顯著抑制斷奶仔豬腸道病原菌的生長,一定劑量的ABPS在體外有抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的效果。

      小腸上皮細(xì)胞間良好的緊密連接結(jié)構(gòu)是維持小腸黏膜發(fā)揮正常屏障功能和吸收功能的前提。而緊密連接是依靠一系列跨膜及外周蛋白相互作用形成的復(fù)合體,其功能依賴于細(xì)胞連接蛋白、細(xì)胞骨架蛋白的正常表達(dá)和分布以及黏附連接的完整性。一旦這些蛋白的表達(dá)和定位發(fā)生改變就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損、通透性增高,各種病原菌及毒素經(jīng)腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán),引起腸道炎癥[19-21]。庾慶華[6]體外(Caco-2細(xì)胞單層模型)和體內(nèi)(大鼠)試驗(yàn)均表明,沙門氏菌SL1344和SARB21感染后,occludin、claudin-1和ZO-1等蛋白的分布較正常組分散,表達(dá)顯著下降,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞輪廓不清晰。RAC1廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞內(nèi),在維持、增強(qiáng)和恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能中發(fā)揮著重要的作用[22]。機(jī)體生理情況下基礎(chǔ)水平的RAC1活性在細(xì)胞黏著連接和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)形成及維持兩者連接上起著重要作用[23]。研究表明,運(yùn)用RAC1抑制劑干擾抑制RAC1的活化,將導(dǎo)致黏著連接復(fù)合體的破壞以及細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白之間連接的破壞[24-26]。本研究結(jié)果表明,培養(yǎng)基中添加ABPS,能顯著上調(diào)IPEC-1細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白(RAC1、ZO-1、occludin、claudin-1)mRNA的相對(duì)表達(dá)量,顯著抑制沙門氏菌的侵染,這說明ABPS能通過促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白mRNA表達(dá),維持腸道黏膜結(jié)構(gòu)的完整,從而抑制病原菌的侵染。

      4 結(jié) 論

      ① ABPS濃度在0~400 μg/mL對(duì)IEPC-1的增殖無顯著的影響。

      ② ABPS處理后的IEPC-1能顯著抑制沙門氏菌的侵染,隨著ABPS濃度的增加,其抑制效果呈先增加后降低的變化。

      ③ 50、200 μg/mL ABPS可以顯著上調(diào)IEPC-1緊密連接相關(guān)蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

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