羥基蛋氨酸鋅對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

齊 茜 李佶隆 馬淑雪 劉 幸 高玉鵬 閔育娜

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌712100)

蛋雞產(chǎn)蛋后期，因長(zhǎng)時(shí)間保持旺盛的脂質(zhì)代謝，產(chǎn)蛋性能下降，生理機(jī)能逐漸弱化，健康狀態(tài)不容樂觀。鋅存在于所有的生物體中，調(diào)控機(jī)體多種代謝途徑，參與機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和免疫應(yīng)答[1]；鋅在蛋白質(zhì)合成[2]、蛋白質(zhì)沉積和蛋殼膜峽部沉積過程中起到了重要作用[3]；鋅參與調(diào)節(jié)先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，缺鋅導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能障礙[4]，影響上皮細(xì)胞質(zhì)量；在大鼠飼喂缺鋅飼糧30 d后血漿瘦素含量、機(jī)體代謝率、酶活性顯著降低[5]。

在生產(chǎn)中通常添加的無機(jī)鋅以二價(jià)金屬游離狀態(tài)被吸收，這種添加方式易與植酸鹽或木質(zhì)素螯合降低鋅的利用率。羥基蛋氨酸鋅(MHA-Zn)是蛋氨酸羥基類似物與鋅螯合成的一種有機(jī)鋅，在動(dòng)物生產(chǎn)中具有毒性低、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、適口性好及無刺激作用等優(yōu)點(diǎn)[6]。研究表明，有機(jī)鋅(例如氨基酸鋅)通過氨基酸或小肽的方式被吸收，比無機(jī)鋅利用率更高[7]，排放少，對(duì)環(huán)境造成的污染小。因此，用MHA-Zn替代無機(jī)鋅可降低鋅的添加水平。鋅影響蛋和蛋殼品質(zhì)，飼糧添加80 mg/kg鋅可增加蛋殼強(qiáng)度[8]，過量添加則降低平均蛋重[9]；鋅調(diào)控蛋殼結(jié)構(gòu)，影響蛋殼的沉積和超微晶體結(jié)構(gòu)[10]；低劑量的有機(jī)鋅能夠滿足生產(chǎn)需要[11]；無機(jī)鋅添加水平達(dá)到70 mg/kg時(shí)在生產(chǎn)中效果更好[12]。對(duì)于MHA-Zn替代無機(jī)鋅在蛋雞飼糧中的應(yīng)用研究較少，且尚未研究不同鋅源對(duì)免疫調(diào)控的分子機(jī)制。利用MHA-Zn部分或全部替代生產(chǎn)中常用的無機(jī)鋅，可能對(duì)蛋雞的生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)和機(jī)體免疫功能達(dá)到相應(yīng)效果?；诖耍驹囼?yàn)進(jìn)一步探討飼糧中MHA-Zn的適宜添加水平及其對(duì)免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在揭示其調(diào)控蛋雞免疫的分子機(jī)制，為提高產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)鋅源分別為硫酸鋅(鋅含量≥34.5%)和MHA-Zn(羥基蛋氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，鋅含量為12.1%，螯合率90%)，由上海諾偉司公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取960只健康、產(chǎn)蛋性能基本一致的57周齡末海蘭灰蛋雞，采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分成4個(gè)組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30只。參照NRC(1994)蛋雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合海蘭公司推薦的飼糧營(yíng)養(yǎng)水平，設(shè)計(jì)玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧(鋅含量35.08 mg/kg)，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。預(yù)試期蛋雞飼喂不補(bǔ)充鋅的基礎(chǔ)飼糧。正試期對(duì)照組在基礎(chǔ)飼糧中添加80 mg/kg硫酸鋅(以鋅計(jì))，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加20、40和80 mg/kg MHA-Zn(以鋅計(jì))。試驗(yàn)期16周，其中預(yù)試期4周(57～60周齡)，正試期12周(61～72周齡)。

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)雞場(chǎng)進(jìn)行。3層階梯式籠養(yǎng)，每籠2只雞，有窗雞舍。同一組的雞均勻分布于雞舍不同空間，自由采食、飲水，機(jī)械清糞，每天光照16 h。雞舍溫度18～29 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。每天飼喂3次(08:00、11:00、16:00)，17:00收集雞蛋。每天觀察雞群健康狀況，記錄死淘雞數(shù)。常規(guī)免疫、消毒和飼養(yǎng)管理。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 10 000 IU，VD31 800 IU，VE 10 IU，VK 10 mg，VB125 μg，硫胺素 thiamine l mg，核黃素 riboflavin 4.5 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 50 mg，煙酸 niacin 24.5 mg，吡哆醇 pyridoxine 5 mg，生物素 biotin 1 mg，葉酸 folic acid 1 mg，膽堿 choline 500 mg，Mn 60 mg，I 0.4 mg，F(xiàn)e 80 mg，Cu 8 mg，Se 0.3 mg。

2)粗蛋白質(zhì)、鈣、總磷和鋅為實(shí)測(cè)值，其余為計(jì)算值。CP, Ca, TP and Zn were measured values, while the others were calculated values.

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生產(chǎn)性能

正試期間，以重復(fù)為單位記錄每天產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重、喂料量、雞只存欄數(shù)、破蛋數(shù)，每周稱1次剩余料量，最后計(jì)算試驗(yàn)前期(61～64周齡)、試驗(yàn)中期(65～68周齡)和試驗(yàn)后期(69～72周齡)的產(chǎn)蛋率、日產(chǎn)蛋重、平均蛋重、平均日采食量和料蛋比。

1.4.2 蛋品質(zhì)

正試期第4、8和12周末，連續(xù)2 d，每重復(fù)隨機(jī)選取3枚正常雞蛋，測(cè)定蛋品質(zhì)，蛋品質(zhì)指標(biāo)包括：蛋重、蛋白高度、蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋形指數(shù)、蛋黃顏色、哈夫單位、破蛋率。蛋殼厚度是在雞蛋上取上、中、下3點(diǎn)，用蛋殼厚度測(cè)定儀(ETG-1601A，Robotmation公司，日本)測(cè)定取平均值，蛋殼強(qiáng)度由蛋殼強(qiáng)度測(cè)定儀(EFG-0503，Robotmation公司，日本)測(cè)定，蛋白高度、蛋黃顏色和哈夫單位采用蛋品質(zhì)自動(dòng)分析儀(EMT-5200，Robotmation公司，日本)測(cè)定。

1.4.3 脾臟中炎癥免疫細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá)

試驗(yàn)期末(72周齡末)從每重復(fù)隨機(jī)選取1只健康、體重接近平均體重的蛋雞，采血后屠宰，分別取同部位的脾臟組織2 g左右，迅速剪成30～50 mg大小的組織塊，放入凍存管置于液氮中速凍，-80 ℃保存待測(cè)。

采用Trizol試劑盒(TaKaRa)提取樣品中的總RNA，經(jīng)核酸濃度分析儀測(cè)定吸光度在260和280 nm處的比值在1.80～2.10，自動(dòng)記錄各濃度。

瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)其RNA質(zhì)量。取RNA樣品1 μg，參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。采用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，PCR引物序列見表2。以cDNA為模板，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)脾臟中炎癥免疫相關(guān)基因[核因子-κB1(NF-κB1)、細(xì)胞白介素-10(IL-10)、細(xì)胞白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]mRNA的相對(duì)表達(dá)量，應(yīng)用Appiled Biosystems 7300 Real Time PCR System操作。20 μL反應(yīng)體系包括：10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，2 μL cDNA，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物，0.4 μL ROX Reference Dye，6 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性0.05 s，60 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的閾值循環(huán)(CT)，采用2-△△CT法計(jì)算樣品中各目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表2 PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行初步處理，用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析，組間均值用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 MHA-Zn對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表3可知，各組之間蛋雞的平均日采食量、產(chǎn)蛋率、料蛋比、日產(chǎn)蛋重和平均蛋重在試驗(yàn)前期、試驗(yàn)中期和試驗(yàn)后期均差異不顯著(P>0.05)。

2.2 MHA-Zn對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由表4可知，各組之間雞蛋的蛋黃顏色、哈夫單位和蛋白高度均差異不顯著(P>0.05)。40和80 mg/kg MHA-Zn組試驗(yàn)前期、試驗(yàn)中期和試驗(yàn)后期雞蛋的蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度均顯著高于對(duì)照組和20 mg/kg MHA-Zn組(P<0.05)。40、80 mg/kg MHA-Zn組試驗(yàn)前期、試驗(yàn)中期和試驗(yàn)后期雞蛋的破蛋率均顯著低于對(duì)照組和20 mg/kg MHA-Zn組(P<0.05)。

表3 MHA-Zn對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表4 MHA-Zn對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

2.3 MHA-Zn對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞脾臟免疫相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由表5可知，80 mg/kg MHA-Zn組脾臟IL-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著低于40 mg/kg MHA-Zn組(P<0.05)，40 mg/kg MHA-Zn組顯著低于20 mg/kg MHA-Zn組(P<0.05)。各組之間脾臟TNF-α、IL-10和NF-κB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均差異不顯著(P>0.05)。

表5 MHA-Zn對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞脾臟免疫相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 MHA-Zn對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響

鋅是機(jī)體重要的微量元素，參與機(jī)體多種酶的合成。研究表明，飼糧中添加不同水平的鋅能夠提高肉雞的生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)[13]，這可能是由于鋅對(duì)于維持金屬蛋白的結(jié)構(gòu)有著至關(guān)重要的作用，缺鋅會(huì)影響肉雞的蛋白質(zhì)代謝[14]。研究表明，有機(jī)鋅的利用率高于無機(jī)鋅，在飼糧中添加蛋氨酸鋅能夠顯著提高蛋雞的生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)和免疫機(jī)能[15]。薛穎等[16]研究表明，以有機(jī)形式添加復(fù)合微量元素時(shí)可以顯著提高產(chǎn)蛋率，降低料蛋比?；A(chǔ)飼糧中添加70、140 mg/kg蛋氨酸鋅能夠顯著提高日產(chǎn)蛋重和產(chǎn)蛋率，降低料蛋比[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加不同水平的MHA-Zn對(duì)蛋雞產(chǎn)蛋后期平均日采食量、料蛋比、平均蛋重、產(chǎn)蛋率和日產(chǎn)蛋重均無顯著影響。這與前人的研究結(jié)果不一致，可能是由于本試驗(yàn)中基礎(chǔ)飼糧中鋅含量為35.08 mg/kg，已經(jīng)達(dá)到蛋雞生長(zhǎng)與生產(chǎn)的需要量，在基礎(chǔ)飼糧上再添加鋅，部分生產(chǎn)性能并不會(huì)隨著飼糧鋅添加水平的增加而提高。同時(shí)，飼糧中銅、錳、鐵含量為固定值，添加高水平的鋅會(huì)因元素間拮抗的作用而影響吸收利用。

3.2 MHA-Zn對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響

3.3 MHA-Zn對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞脾臟免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

鋅缺乏會(huì)影響機(jī)體免疫功能[5]。越來越多的文獻(xiàn)表明，鋅作為炎癥免疫信號(hào)通路核因子-κB(NF-κB)信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子，影響炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[20]。在機(jī)體鋅缺乏時(shí)會(huì)使促炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和TNF-α的表達(dá)上調(diào)[21]。NF-κB1是一種介導(dǎo)促炎反應(yīng)的高度保守的核轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)NF-κB1與細(xì)胞凋亡的關(guān)系也相當(dāng)密切，其參與多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，具有抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙向作用。IL-8是免疫趨化因子，主要調(diào)節(jié)體內(nèi)造血細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖和分化，可導(dǎo)致機(jī)體局部炎癥反應(yīng)[22]。IL-10作用于多種免疫細(xì)胞，抑制白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、白細(xì)胞介素-12(IL-12)和TNF-α等促炎細(xì)胞因子[23]。在肉雞試驗(yàn)中，通過對(duì)種雞和子代肉雞提供低高劑量有機(jī)鋅，可顯著降低促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，而低劑量有機(jī)鋅組結(jié)果則相反；同時(shí)種雞詞喂高劑量無機(jī)鋅組的子代肉雞空腸的IL-6、IL-1β和IL-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著低于種雞詞喂正常劑量有機(jī)鋅組[24]。在人體內(nèi)補(bǔ)充鋅能夠通過結(jié)合鋅指蛋白A20，抑制NF-κB活化來降低IL-1β和TNF-αmRNA的相對(duì)表達(dá)量，從而下調(diào)炎癥細(xì)胞因子[16]。飼糧添加有機(jī)鋅能夠提高動(dòng)物的抗氧化能力，在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，飼糧添加MHA-Zn能夠顯著提高蛋雞血清和肝臟中的總抗氧化能力[11]。

本試驗(yàn)中，與20 mg/kgMHA-Zn組相比，80 mg/kg MHA-Zn組促炎細(xì)胞因子IL-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，這與李昌武[24]的研究結(jié)果一致，李昌武[24]研究表明，在添加低劑量鋅的飼糧條件下，促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)。本試驗(yàn)中，飼糧添加不同水平的MHA-Zn對(duì)脾臟NF-κB1、TNF-α和IL-10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均無顯著影響。這可能是由于試驗(yàn)動(dòng)物年齡與生理狀態(tài)的差異，蛋雞產(chǎn)蛋后期各項(xiàng)生理機(jī)能都處于較低水平，也可能由于微量元素之間的互作效應(yīng)，短期鋅營(yíng)養(yǎng)的變化可能影響其他微量元素的吸收。

4 結(jié) 論

飼糧添加40和80 mg/kg MHA-Zn可顯著提高蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度，顯著降低破蛋率，顯著降低脾臟促炎因子IL-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。建議產(chǎn)蛋后期蛋雞飼糧中MHA-Zn的適宜添加水平為40 mg/kg。