急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道屏障分子、營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和腺苷酸活化蛋白激酶的影響

周華金 張 輝 王繼光 郝洋洋 鐘 光 宋志剛

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)，泰安271018)

動(dòng)物易受到高溫環(huán)境的影響，肉雞因其體溫高、無(wú)汗腺以及代謝旺盛等特點(diǎn)更容易遭受熱應(yīng)激的危害。腸道既是消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，又是保護(hù)機(jī)體免受食物抗原、病原微生物等損害的先天性屏障。胃腸道對(duì)體溫的上升高度敏感，大量病理學(xué)研究表明熱應(yīng)激引發(fā)的黏膜損傷與內(nèi)毒素(ET)血癥、缺氧和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[1-4]。腸腔內(nèi)的單層上皮細(xì)胞作為物理屏障參與機(jī)體黏膜防御系統(tǒng)的組成[5]。屏障功能由相鄰細(xì)胞間的連接得以維持，其中，緊密連接通過(guò)控制細(xì)胞旁通透性在屏障功能完整性上發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。已有研究表明熱應(yīng)激破壞小鼠腸道緊密連接和微絨毛結(jié)構(gòu)[7]；熱應(yīng)激可引發(fā)多灶性淋巴漿細(xì)胞性腸炎，并降低肉雞的采食量和體增重[2]。考慮到腸道屏障性能并非維持現(xiàn)狀，而是由隱窩干細(xì)胞不斷地增殖、分化，并脫落在腸腔表面，對(duì)屏障性能進(jìn)行動(dòng)態(tài)修復(fù)[8]。本試驗(yàn)通過(guò)探究急性熱應(yīng)激后腸道屏障緊密連接蛋白[閉合蛋白(claudin)-1、閉鎖蛋白(occludin)和閉合小環(huán)蛋白-1(ZO-1)]、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體[陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CAT)-1、寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(PepT-1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(GLUT-2)]以及能量調(diào)控信號(hào)通路中肝激酶B1(LKB1)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α1基因表達(dá)的變化，從腸道的屏障功能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及能量調(diào)控3個(gè)方面分析熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取80只體況基本一致的28日齡健康愛(ài)拔益加(AA)肉仔雞，隨機(jī)分為熱應(yīng)激組(試驗(yàn)組)和對(duì)照組，每組40只雞，分為8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只雞。試驗(yàn)在2間設(shè)施條件完全相同的小型雞舍(10 m2左右)進(jìn)行，雞舍整體進(jìn)行隔熱處理，配置加熱器、空調(diào)和加濕器。所有雞飼養(yǎng)在同一層雞籠，利用空調(diào)和加熱器控制雞舍內(nèi)溫度，根據(jù)溫度計(jì)監(jiān)測(cè)雞舍內(nèi)溫度。熱應(yīng)激組08:00—18:00進(jìn)行10 h急性熱應(yīng)激，溫度為(35±1) ℃，對(duì)照組全天室溫(23±1) ℃。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)期間肉仔雞飼養(yǎng)在2間設(shè)施條件完全相同的雞舍中，采用籠養(yǎng)，執(zhí)行24 h光照程序(白天18 h，晚上6 h)，飼喂參照NRC(1994)肉雞營(yíng)養(yǎng)需要量標(biāo)準(zhǔn)配制的基礎(chǔ)飼糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。每天記錄各重復(fù)的耗料量，飼養(yǎng)階段自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content1～21日齡 1 to 21 days of age22～33日齡 22 to 33 days of age蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.870.82蘇氨酸 Thr0.760.71色氨酸 Trp0.220.20

1)多維和多礦為每千克飼糧提供 Multi-vitamin and multi-mineral provided the following per kg of diets：VA 9 000 IU，VD32 000 IU，VE 11.0 IU，VK 1.00 mg，硫胺素 thiamine 1.20 mg，核黃素 riboflavin 5.80 mg，煙酸 niacin 66.0 mg，泛酸 pantothenic acid 10.0 mg，吡哆醇 pyridoxine 2.60 mg，生物素 biotin 0.20 mg，葉酸 folic acid 0.70 mg，VB120.012 mg，Mn 100 mg，Zn 75.0 mg，F(xiàn)e 80.0 mg，I 0.65 mg，Cu 8.00 mg，Se 0.35 mg。

2)營(yíng)養(yǎng)水平為計(jì)算值。 Nutrient levels were calculated values.

1.3 樣品采集

肉雞28日齡開(kāi)始試驗(yàn)，急性熱應(yīng)激10 h后，所有雞進(jìn)行稱重，試驗(yàn)組和對(duì)照組每重復(fù)各選擇1只接近平均體重的雞，同時(shí)進(jìn)行采樣。翅靜脈采血，離心分離血清，屠宰后迅速打開(kāi)腹腔，取出空腸，并剪取空腸前段約10 cm的腸段組織，在無(wú)菌生理鹽水中漂洗后，采集黏膜樣本，迅速放于液氮中保存。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能

每天記錄各重復(fù)的耗料量，準(zhǔn)確記錄28日齡各重復(fù)的初始雞重，10 h熱應(yīng)激結(jié)束后統(tǒng)計(jì)各重復(fù)雞重、耗料量以及采樣雞重。

體增重=總雞重+死亡雞重-初始雞重；
總采食量=加料重-余料重；
平均采食量=總采食量/總雞數(shù)；
料重比=總采食量/體增重；
存活率=100×存欄雞數(shù)/總雞數(shù)。

1.4.2 血清指標(biāo)

翅靜脈采血，血液于常溫傾斜靜置，待血清析出后，離心機(jī)(飛鴿KA-1000型，上海安亭科學(xué)儀器廠)以3 000 r/min離心10 min，取血清，-20 ℃保存待測(cè)。全自動(dòng)生化分析儀(7170A，HITACHI,日本)測(cè)定血清葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TCHO)和甘油三酯(TG)含量。采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清ET含量，所需試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，使用ELx808酶標(biāo)儀(Gene有限公司)測(cè)定。

1.4.3 空腸黏膜基因mRNA表達(dá)量的測(cè)定

空腸黏膜總RNA的提取按照動(dòng)物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的總RNA用微量紫外分光光度計(jì)(DS-11,DeNovix,美國(guó))在260 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)RNA的濃度和純度。

cDNA的合成采用羅氏第1鏈cDNA合成試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche,德國(guó))，反應(yīng)體系為20 μL，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)：25 ℃ 10 min，55 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后于-20 ℃保存待用。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序：第1步預(yù)變性，95 ℃ 10 s；第2步PCR反應(yīng)，95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。所有引物均根據(jù)FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)試劑盒要求，參照GenBank上已發(fā)表的序列，采用DNAMAN 5.0設(shè)計(jì)(跨內(nèi)含子)，引物DNA由上海生工生物工程公司合成，引物序列見(jiàn)表2。

參照Livak等[9]的方法用2-ΔΔCT法定量目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量，以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和TATA盒結(jié)合蛋白(TBP)作為內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

基因表達(dá)結(jié)果采用相對(duì)表達(dá)量的形式，β-actin和TBP作為內(nèi)參基因。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，置信區(qū)間為95%，P<0.05表示處理效應(yīng)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，急性熱應(yīng)激顯著降低了肉仔雞的平均體增重和平均采食量(P<0.05)，顯著提高了料重比(P<0.05)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

表3 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞血清指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉仔雞血清ET含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞血清GLU、TG和TCHO含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.3 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道屏障基因表達(dá)的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞空腸黏膜occludin和claudin-1基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)，顯著提高肉仔雞空腸黏膜ZO-1基因的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

2.4 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞空腸黏膜CAT-1、PepT-1和GLUT-2基因的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表4 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞血清指標(biāo)的影響

柱形圖標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Column diagrams with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖1急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道屏障基因表達(dá)的影響

Fig.1 Effects of acute heat stress on intestinal
barrier gene expression of broilers

圖2 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

2.5 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道LKB1和AMPKα1基因表達(dá)的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉仔雞空腸黏膜AMPKα1基因的相對(duì)表達(dá)量有上升趨勢(shì)(P=0.060 3)，肉仔雞空腸黏膜LKB1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。

圖3 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道LKB1和

3 討 論

3.1 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能和血清指標(biāo)的影響

熱應(yīng)激一直以來(lái)是影響肉雞生長(zhǎng)性能的重要環(huán)境因素。本研究結(jié)果顯示急性熱應(yīng)激顯著降低了肉仔雞平均采食量和平均體增重，顯著提高了料重比，總體降低了肉仔雞生長(zhǎng)性能，這與前人研究結(jié)果[10-14]一致。已有研究表明，熱應(yīng)激誘導(dǎo)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)的激活，腎上腺皮質(zhì)大量釋放皮質(zhì)酮影響采食行為是造成生長(zhǎng)性能下降的主要因素[10]。相關(guān)研究顯示，機(jī)體在應(yīng)激條件下通過(guò)促進(jìn)體內(nèi)GLU的動(dòng)員和生產(chǎn)提高血糖水平以維持穩(wěn)態(tài)[15]。急性應(yīng)激下，HPA軸通過(guò)與腎上腺素、胰島素、胰高血糖素和交感神經(jīng)系統(tǒng)的互作，提高血糖水平，滿足機(jī)體重要器官的能量供給[13]。而在長(zhǎng)期應(yīng)激時(shí)，HPA軸糖皮質(zhì)激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)障礙，會(huì)持續(xù)促進(jìn)糖皮質(zhì)激素分泌，使脂肪和肌肉組織的脂肪動(dòng)員和肝臟糖異生加強(qiáng)，導(dǎo)致游離脂肪酸和血糖水平升高[16]。本研究結(jié)果證實(shí)，急性熱應(yīng)激造成肉仔雞生長(zhǎng)性能下降，與前人研究結(jié)果相一致。

3.2 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道屏障完整性的影響

腸道上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IEC)具有物理屏障功能，可以將腸腔內(nèi)容物所在的嚴(yán)酷外界環(huán)境與組織內(nèi)部環(huán)境分離開(kāi)來(lái)，防止外來(lái)病原物的入侵，因此IEC可介導(dǎo)急性非特異性免疫反應(yīng)，參與機(jī)體第一道防線，在先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[17-19]。IEC的完整性是維持內(nèi)外環(huán)境間這種具有選擇性的物理屏障的關(guān)鍵，緊密連接作為重要的細(xì)胞間連接環(huán)繞在上皮細(xì)胞頂端，能夠控制物質(zhì)穿越上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)，在維持IEC完整性上至關(guān)重要，其通透性決定著整個(gè)腸上皮細(xì)胞的屏障功能[20-21]。當(dāng)腸道屏障受損時(shí)，細(xì)菌移位穿越腸上皮細(xì)胞，增加了腸道病原菌感染的機(jī)率，細(xì)菌代謝過(guò)程中產(chǎn)生的ET隨之進(jìn)入血液循環(huán)，因此血液ET含量間接反映了腸道屏障的完整性[22-23]。在本研究中，急性熱應(yīng)激顯著提高了肉雞血清ET含量，說(shuō)明熱應(yīng)激增加了緊密連接的通透性，腸道屏障的完整性受損。

3.3 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道緊密連接蛋白基因表達(dá)的影響

機(jī)體對(duì)熱應(yīng)激的另一個(gè)重要的適應(yīng)性反應(yīng)是增加外周血流量，進(jìn)而導(dǎo)致腸內(nèi)供血減少和缺氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]。而腸上皮缺血會(huì)導(dǎo)致腸道緊密連接和黏著連接的功能障礙使腸道屏障受損[25]。在豬和大鼠上的研究證實(shí)，熱應(yīng)激對(duì)腸道緊密連接影響顯著，生長(zhǎng)豬熱應(yīng)激24 h導(dǎo)致了claudin-1、occludin和ZO-1的mRNA表達(dá)上升，occludin和claudin-3的蛋白表達(dá)同樣有所上升，并且基因水平的變化先于蛋白水平的變化[26-27]；大鼠于40 ℃環(huán)境下每天熱應(yīng)激2 h，連續(xù)應(yīng)激3 d后發(fā)現(xiàn)緊密連接結(jié)構(gòu)損傷，絨毛高度縮短，腸上皮細(xì)胞脫落從而暴露固有層，導(dǎo)致細(xì)菌移位[28]。本研究中，急性熱應(yīng)激10 h造成肉仔雞空腸黏膜ZO-1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上升。在羅斯肉雞上的研究表明，熱應(yīng)激顯著提高了空腸claudin-5和ZO-1的基因表達(dá)，而并沒(méi)有影響occludin的基因表達(dá)[24]，這與本研究結(jié)果相似。

3.4 急性熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的影響

腸道吸收飼糧中的蛋白質(zhì)是通過(guò)蛋白酶、肽酶、氨基酸和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同完成，腸道發(fā)育、遺傳選擇以及飼糧粗蛋白質(zhì)的含量和質(zhì)量等都可以調(diào)節(jié)雞小腸氨基酸和小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[29]。早期研究表明熱應(yīng)激可降低肉雞蛋白質(zhì)和氨基酸消化率[30]，近期有報(bào)道進(jìn)一步證實(shí)熱應(yīng)激通過(guò)影響氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白降低肉雞生長(zhǎng)性能[32]。CAT作為重要的轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的蛋白可以介導(dǎo)陽(yáng)離子氨基酸的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，從而支持蛋白質(zhì)的合成、一氧化氮合成以及多胺生物合成等重要代謝功能。有研究證明敲除CAT基因后的小鼠不能存活[32]，進(jìn)一步論證了該基因的重要性。

蛋白質(zhì)通過(guò)消化酶降解后除了產(chǎn)生游離氨基酸外，還有一部分小肽(主要是二肽和三肽)，通過(guò)小腸刷狀緣膜PepT-1進(jìn)入細(xì)胞后，水解形成游離氨基酸以進(jìn)入門(mén)靜脈血[33]。在對(duì)小肽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)研究中，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體常作為主要的研究對(duì)象，其RNA表達(dá)數(shù)量及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性或數(shù)量，也被作為主要的研究指標(biāo)。在本研究中，急性熱應(yīng)激10 h并未造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT-1、PepT-1和GLUT-2基因相對(duì)表達(dá)量的顯著變化，其原因可能與熱應(yīng)激的模型有關(guān)，短時(shí)間急性熱應(yīng)激沒(méi)有對(duì)其基因表達(dá)造成影響。

3.5 熱應(yīng)激對(duì)肉仔雞腸道AMPK信號(hào)通路基因表達(dá)的影響

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在大多數(shù)真核組織中對(duì)細(xì)胞能量的平衡至關(guān)重要。不同的生理應(yīng)激誘導(dǎo)ATP消耗，使細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP值增加，從而導(dǎo)致AMPK活性增加[34]。LKB1是AMPK主要的上游激酶，幾乎在所有的組織中表達(dá)[35]。大量研究表明熱應(yīng)激可影響AMPK活性，巖蟹在18～30 ℃熱應(yīng)激處理期間，AMPK活性上升9.1倍[36]；對(duì)C2C12肌管進(jìn)行1 h輕度熱應(yīng)激可提高AMPK活性[37]；熱應(yīng)激條件下奶牛AMPK活性上升[38]。在家禽上，夏季高溫應(yīng)激造成了肉雞胸肌組織中AMP/ATP值、AMPK活性顯著升高[39]；LKB1基因已證實(shí)在雞腸道中表達(dá)，并且存在與哺乳動(dòng)物功能相同的LKB1-AMPK信號(hào)通路[40]。本研究中，試驗(yàn)組肉仔雞空腸黏膜AMPKα1基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比有上升，但并未出現(xiàn)顯著差異，而試驗(yàn)組肉仔雞空腸黏膜LKB1基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明熱應(yīng)激可激活A(yù)MPK上游激酶。

4 結(jié) 論

急性熱應(yīng)激顯著降低肉仔雞生長(zhǎng)性能，損傷腸道屏障，但對(duì)腸道氨基酸、小肽及GLU的轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有造成影響；急性熱應(yīng)激影響肉仔雞空腸黏膜LKB1基因的表達(dá)。