肌球蛋白輕鏈激酶介導(dǎo)腸黏膜上皮屏障功能變化的研究進展

王夢雅 高 民 徐 明 胡紅蓮*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特010031)

腸道是動物機體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，而黏膜作為腸道上皮的重要屏障，可有效阻擋腸道內(nèi)微生物及其毒素向體內(nèi)其他組織器官和血液循環(huán)擴散[1]，在侵襲與抗侵襲過程中保持動態(tài)穩(wěn)定[2]。腸黏膜上皮屏障的完整性對于維持消化系統(tǒng)甚至整個動物機體的健康具有重要作用，當其遭到破壞或功能失調(diào)會促進腸道感染性疾病的發(fā)生，嚴重時會導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)或多器官功能衰竭[3-4]。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)是腸黏膜上皮屏障功能變化最主要的鈣調(diào)素激酶，隨著對其結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，MLCK在介導(dǎo)腸黏膜上皮通透性改變中所起的作用受到眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注，近年來已成為分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。因此，了解MLCK介導(dǎo)腸黏膜上皮屏障功能變化的調(diào)控機制對動物營養(yǎng)學(xué)研究具有重要意義。

1 MLCK的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能

1.1 MLCK的基本結(jié)構(gòu)

MLCK是第1個被發(fā)現(xiàn)的依賴于鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在真核生物的肌細胞以及哺乳動物的非肌細胞中動態(tài)調(diào)節(jié)肌動球蛋白重組和細胞收縮[5]。MLCK在哺乳動物中主要有mylk1和mylk2 2種基因編碼[6]，分為橫紋肌型MLCK(skeletal muscle MLCK,skMLCK)和平滑肌型MLCK(smooth muscle MLCK,smMLCK)，二者分別位于不同的染色體上，其中skMLCK僅限于在骨骼肌組織中表達，其基因編碼1個催化結(jié)構(gòu)域以及由自動抑制區(qū)和Ca2+/CaM結(jié)合序列組成的調(diào)節(jié)區(qū)域[7]。但由于啟動子的不同，smMLCK以細胞特異性方式表達出3種轉(zhuǎn)錄本。其中分子質(zhì)量為130 ku的稱為短鏈MLCK(S-MLCK)，在機體的大多數(shù)組織中都有表達，其在胃腸道基本緊張狀態(tài)的維持、胃排空以及小腸推動等基本動力方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[8]；而分子質(zhì)量為220 ku的稱為長鏈MLCK(L-MLCK)，主要分布于胚胎組織、體外培養(yǎng)細胞、上皮細胞和非肌細胞中[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在腸上皮細胞中，肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)發(fā)生磷酸化主要是由L-MLCK表達所引起[10]。smMLCK基因的第3種轉(zhuǎn)錄本編碼的是C末端的免疫球蛋白T(lgT)樣結(jié)構(gòu)。

Feng等[11]研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物smMLCK保守結(jié)構(gòu)域如圖1所示。smMLCK N末端的肌動蛋白結(jié)合位點由3個DFRxxL基序組成，且能與純化的F肌動蛋白結(jié)合，將酶鎖定在收縮裝置內(nèi)[12-13]。免疫球蛋白(Ig)1和Ig2 2個結(jié)構(gòu)域也與肌動蛋白結(jié)合[14]，而IgT結(jié)構(gòu)域與C末端的平滑肌肌球蛋白(smooth muscle myosin,SMM)結(jié)合，該結(jié)構(gòu)蛋白對于維持平滑肌細胞中肌球蛋白纖維的穩(wěn)定性具有重要作用[15]。中心激酶結(jié)構(gòu)域作為MLCK、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)以及調(diào)節(jié)性肌球蛋白Ⅱ輕鏈(regulatory myosin Ⅱ light chain,RLC)結(jié)合位點的催化部位，可將ATP上的磷酸轉(zhuǎn)運到底物上[16]。

DFRxxL：D、F、R和L分別為天冬氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和亮氨酸，x為任意氨基酸；Actin binding：肌動蛋白結(jié)合位點；CaM binding：鈣調(diào)蛋白結(jié)構(gòu)域；Proline rich repeat：富脯氨酸重復(fù)序列；Function unknown：功能未知；Ig1：免疫球蛋白1；Ig2：免疫球蛋白2；Fn：纖維蛋白3型結(jié)構(gòu)域；Catalytic：催化；Kinase：激酶結(jié)構(gòu)域；RLC and ATP binding：調(diào)節(jié)性肌球蛋白Ⅱ輕鏈和三磷酸腺苷結(jié)合位點；Autoinhibitory：自抑制作用；IgT：免疫球蛋白T；Myosin binding：肌球蛋白結(jié)合位點；Telokin Ig：免疫球蛋白超級家族Telokin蛋白。

圖1哺乳動物smMLCK結(jié)構(gòu)域

Fig.1 Domain structure of smMLCK of mammalian[11]

除此之外，在非脊椎動物中也發(fā)現(xiàn)了與MLCK有關(guān)的激酶。在果蠅中，1個有復(fù)雜啟動子的基因會產(chǎn)生多個具有相同末端的轉(zhuǎn)錄本[17]，較小的轉(zhuǎn)錄本(3.2～5.2 kb)編碼的蛋白質(zhì)與哺乳動物的MLCK大小相似；而較大的轉(zhuǎn)錄本(13～25 kb)編碼的蛋白質(zhì)類似于哺乳動物的蛋白質(zhì)titins；最大的轉(zhuǎn)錄本(25 kb)編碼1個926 ku的stretchin MLCK。另外，在線蟲和海兔中表達的MLCK相關(guān)激酶為twitchin，其也有1個結(jié)合到催化結(jié)構(gòu)域上的自動抑制區(qū)，但不含有Ca2+/CaM結(jié)合序列，是由Ca2+結(jié)合蛋白S100A12激活[18]。在盤基網(wǎng)柄菌中表達的MLCK只含有催化結(jié)構(gòu)域和被磷酸化以激活的調(diào)節(jié)區(qū)域，是結(jié)構(gòu)最為簡單的一種[19]。

1.2 MLCK的生物學(xué)功能

MLCK是細胞收縮的關(guān)鍵調(diào)控因子，其主要功能是介導(dǎo)MLC發(fā)生磷酸化[20-21]，研究表明，Ca2+/CaM是MLCK活性最重要的調(diào)節(jié)器。當外來不同信號刺激時，細胞內(nèi)游離的Ca2+濃度升高，Ca2+首先與CaM結(jié)合形成Ca2+/CaM復(fù)合體，MLCK能夠與Ca2+/CaM復(fù)合體結(jié)合解除MLCK的天然抑制序列，形成激活的p-MLCK[7,11]。而p-MLCK使MLC上第18位蘇氨酸(Thr18)和第19位絲氨酸(Ser19)殘基的磷酸化水平升高，改變MLC的空間構(gòu)象[22]。磷酸化的MLC可活化肌球蛋白重鏈頭部的ATP酶，所產(chǎn)生的能量使肌動蛋白與肌球蛋白相互作用，介導(dǎo)肌動蛋白發(fā)生收縮。Ca2+/CaM也可與DFRxxL結(jié)合導(dǎo)致肌動蛋白結(jié)合減弱[23]，使細胞骨架肌動蛋白微絲滑動，引起細胞骨架重排，細胞發(fā)生向心性收縮，細胞間的緊密連接(tight junction,TJ)被破壞，直接催化MLC從非磷酸化型向磷酸化型轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致細胞黏膜通透性增加[24]。此外，Kamm等[7]和Simard等[25]研究發(fā)現(xiàn)，MLCK不僅可以調(diào)節(jié)細胞收縮，而且對細胞遷移、運動以及細胞凋亡具有調(diào)控作用。

2 MLCK介導(dǎo)腸黏膜上皮屏障功能變化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

機械屏障作為腸黏膜屏障的重要組成部分，主要由腸上皮細胞和相鄰細胞間的連接構(gòu)成。而細胞要協(xié)調(diào)發(fā)揮各種功能，則有賴于細胞黏著和細胞連接。細胞的連接方式主要分為TJ、黏著連接(adhesion junction,AJ)、間隙連接(gap junction,GJ)和橋粒連接(desmosome junction,DJ)[26]，其中TJ是腸上皮細胞間最重要的連接方式，調(diào)控著水和溶質(zhì)等小分子物質(zhì)的跨上皮轉(zhuǎn)運，是決定細胞間通透性的關(guān)鍵因素[27]，在腸黏膜上皮屏障功能的維護中起著舉足輕重的作用。TJ的結(jié)構(gòu)蛋白主要由跨膜蛋白家族(包括緊密連接蛋白Claudin、Occludin)和外周支架蛋白(緊密連接蛋白ZO)構(gòu)成。Blair等[28]研究發(fā)現(xiàn)，MLCK通過調(diào)節(jié)Claudin、Occludin及ZO的蛋白質(zhì)表達，可引起腸黏膜通透性增加，由此可知，MLCK在TJ通透性動態(tài)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[29]。研究表明，上皮細胞收縮性改變是不同原因引起腸黏膜通透性增加的共同通路，主要受骨架蛋白中肌球蛋白和肌動蛋白的影響，肌球蛋白的主要作用是調(diào)控細胞骨架結(jié)構(gòu)并參與細胞的多種生理活動，而這些主要是通過MLC的磷酸化與去磷酸化來實現(xiàn)。MLC發(fā)生磷酸化是生物屏障通透性增加的分子基礎(chǔ)[30-31]，是腸上皮TJ屏障功能障礙的關(guān)鍵所在。多種細胞因子、炎癥介質(zhì)等神經(jīng)及體液介質(zhì)均可通過MLC磷酸化而引起黏膜通透性增加[32-33]。因此，在MLCK介導(dǎo)的腸黏膜上皮細胞通透性增加中，效應(yīng)分子MLC磷酸化是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而MLCK的激活可通過下列途徑進行調(diào)控。

2.1 促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路

MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由Sturgill等[34]首次從3T3-L1脂肪母細胞中純化出來。研究證實，MAPK存在于所有生物體的大多數(shù)細胞內(nèi)，是真核生物細胞重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，可將細胞外信號刺激傳導(dǎo)至細胞及其核內(nèi)部。MAPK通過影響基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，進而影響細胞的生物學(xué)功能[35]。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細胞內(nèi)具有生物進化的高度保守性。目前發(fā)現(xiàn)，MAPK信號系統(tǒng)主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p38 MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)，其中ERK在維持細胞形態(tài)和構(gòu)建細胞骨架方面發(fā)揮重要作用。研究表明，ERK1/2的激活可促使下游轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白1(Elk-1)的激活并遷移到細胞核內(nèi)，與位于最小啟動子區(qū)域(-310～-296)內(nèi)的順式結(jié)合位點相結(jié)合，觸發(fā)MLCK基因活化以及MLC磷酸化，導(dǎo)致腸上皮細胞TJ受損，黏膜通透性增加[36]。另有研究表明，同型半胱氨酸通過促進絲裂原活化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)-ERK-MLCK蛋白磷酸化影響結(jié)腸炎大鼠的腸黏膜通透性，進而加重腸道的炎癥過程[37]。而Al-Sadi等[36]發(fā)現(xiàn)，白細胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)的腸上皮細胞TJ通透性增加是通過ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)MLCK基因表達來介導(dǎo)的，在敲除ERK1/2或使用ERK1/2抑制劑后能有效抑制MLC磷酸化。因此，ERK在MLCK誘導(dǎo)的腸黏膜上皮細胞通透性增加中起到重要作用。

在燒傷引起的小鼠腸道屏障功能損傷中，p38 MAPK信號通路可激活MLCK，導(dǎo)致腸黏膜組織形態(tài)發(fā)生改變，上皮細胞間TJ通透性增加。注射p38 MAPK抑制劑后會降低p38 MAPK磷酸化水平和MLCK基因表達水平。由此可見，MAPK信號通路在MLCK介導(dǎo)的腸黏膜上皮屏障功能紊亂及細胞通透性改變中占據(jù)重要地位。

2.2 MLCK介導(dǎo)的MLC磷酸化信號通路

腸黏膜通透性改變與MLCK的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，而MLC發(fā)生磷酸化是腸黏膜上皮TJ屏障功能障礙的關(guān)鍵所在。Moriez等[38]研究發(fā)現(xiàn)，注射脂多糖后大鼠的上皮細胞TJ擴張，MLCK被激活，MLC磷酸化程度增加，使得細胞收縮和細胞間隙形成，最終影響結(jié)腸黏膜的通透性。注射MLCK特異性抑制劑ML-7后能夠顯著降低MLCK的活性及其所誘導(dǎo)的屏障功能紊亂。研究報道，用炎性因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)處理后的單層上皮細胞模型中，MLCK的表達水平上調(diào)，MLC磷酸化明顯升高，上皮細胞的屏障功能遭到破壞，而這些結(jié)果均能夠被MLCK抑制劑所改善[39]。以上結(jié)果表明，MLCK所介導(dǎo)的MLC磷酸化信號通路在內(nèi)毒素或不同炎性因子所引起的腸上皮屏障功能損害的發(fā)生機制中具有重要作用。

陳傳莉[40]研究表明，小鼠早期嚴重?zé)齻约叭毖跻鸬哪c黏膜通透性升高，會伴隨有MLCK蛋白表達水平及MLC磷酸化程度增加，注射ML-9抑制劑后MLC磷酸化被抑制。除此之外，MLCK所介導(dǎo)的MLC磷酸化信號通路也參與了熱應(yīng)激所導(dǎo)致的腸黏膜上皮屏障功能損害的發(fā)生，當注射ML-7特異性抑制劑后能夠阻止MLC磷酸化以及腸黏膜上皮通透性增加。

MLC磷酸化除了主要受MLCK的調(diào)控外，還受到肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)的負調(diào)控[41]。Rho激酶(Rho kinase,ROCK)能夠與MLCP亞基作用，造成MLCP失活，進而阻止MLCP對MLC的去磷酸化作用，使得胞漿內(nèi)的MLC磷酸化水平增加[42]。嚴重?zé)齻竽c黏膜ROCK激活和MLC磷酸化水平增加，是導(dǎo)致大鼠腸黏膜通透性增加及屏障功能損害的分子機制之一。因此，ROCK激活是導(dǎo)致MLC磷酸化的又一原因。

2.3 蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)

PKC是20世紀70年代被發(fā)現(xiàn)的一類由Ca2+激活的磷脂依賴性蛋白激酶，在哺乳動物的組織、器官以及細胞中廣泛分布，通過蛋白質(zhì)磷酸化的催化作用，對動物細胞生長、分化、代謝、信息傳遞及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等具有重要的調(diào)節(jié)作用[43]。PKC的分子質(zhì)量為70～90 ku，分子結(jié)構(gòu)由N端的調(diào)節(jié)區(qū)域和C端的催化區(qū)域組成，該蛋白激酶一旦被激活會轉(zhuǎn)移到細胞膜對其蛋白底物進行磷酸化作用并引發(fā)許多細胞內(nèi)反應(yīng)[44]，但在不同的細胞中，PKC激活的亞型及主要通路有所不同。作為一種蛋白激酶，PKC可直接作用于MLC的絲氨酸/蘇氨酸殘基，使MLC發(fā)生磷酸化；也可通過激活MLCK，引起細胞骨架蛋白MLC磷酸化而導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)蛋白的重組排列[45]。研究表明，當腸黏膜上皮細胞PKC被激活后，MLCK磷酸化狀態(tài)及其酶活性會發(fā)生改變，進而引起MLC磷酸化狀態(tài)的改變，影響周圍連接肌動球蛋白環(huán)的收縮，最終導(dǎo)致腸黏膜上皮通透性增加[46]。因此，PKC可通過磷酸化MLCK介導(dǎo)腸黏膜上皮屏障功能發(fā)生改變。

2.4 Ca2+濃度

Ca2+在維持腸黏膜上皮正常生理功能中扮演重要角色，細胞內(nèi)游離Ca2+濃度改變調(diào)節(jié)著細胞的能量代謝、蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化修飾、基因表達和調(diào)控等活動[47]。Ca2+是調(diào)節(jié)MLCK活性的最基本介質(zhì)，通過與CaM結(jié)合并激活MLCK是決定MLC磷酸化和引起細胞收縮的重要因素[23,48]。研究表明，細胞外Ca2+濃度降低時能夠激活細胞內(nèi)MLCK的活性，肌動蛋白和肌球蛋白發(fā)生向心性收縮，細胞間TJ破壞，進而導(dǎo)致腸黏膜上皮屏障功能遭到破壞，使其通透性增加[49]。Ma等[50]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+誘導(dǎo)的腸黏膜上皮TJ屏障功能改變與MLCK激活有關(guān)，使用MLCK抑制劑ML-7后能夠阻止MLCK活化以及腸黏膜上皮細胞通透性增加，這說明Ca2+通過活化MLCK引起腸黏膜上皮通透性增加。此外，Ca2+通道是一種細胞膜上的、與Ca2+轉(zhuǎn)運相關(guān)的特定蛋白質(zhì)，其激活對于細胞內(nèi)外Ca2+濃度的調(diào)控至關(guān)重要，Ca2+通道在MLCK介導(dǎo)腸黏膜上皮通透性增加的過程中也發(fā)揮重要作用。

3 小 結(jié)

多種信號分子可通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活MLCK，導(dǎo)致腸黏膜上皮屏障功能紊亂。其中MLCK介導(dǎo)的MLC磷酸化為MLCK介導(dǎo)腸黏膜通透性增加的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時也是細胞內(nèi)多種信號通路的中心環(huán)節(jié)。MLCK活性及其蛋白質(zhì)表達水平增加均可引起MLC磷酸化程度增加，細胞間TJ發(fā)生改變，導(dǎo)致細胞收縮和細胞間隙增大，從而影響腸黏膜上皮屏障功能，通透性增加。近年來，MLCK介導(dǎo)腸黏膜上皮屏障損傷機制的研究取得了很多進展，但有關(guān)這方面的研究主要集中在人類和單胃動物上，在反芻動物上的研究較少，因此，有必要進一步探索MLCK對反芻動物腸黏膜上皮屏障功能及分子調(diào)控機制的影響。同時，隨著大數(shù)據(jù)時代的到來，生物信息學(xué)在動物營養(yǎng)學(xué)代謝疾病的研究中取得廣泛應(yīng)用，這對更好地挖掘參與MLCK介導(dǎo)反芻動物腸黏膜通透性改變的關(guān)鍵信號通路以及相關(guān)的上下游功能基因具有指導(dǎo)意義，更為今后探索防治腸黏膜上皮屏障功能損害的新型技術(shù)措施提供理論依據(jù)。