金槐蘆丁聚酰胺樹脂純化工藝優(yōu)化

王 崢 秦 源

WANG Zhen QIN Yuan

(湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199)

(Department of Biological and Chemical Engineering, Hunan University of Science and Engineering, Yongzhou, Hunan 425199, China)

槐樹自古以來就是中國(guó)藥史上重要的藥食同源植物，有“金藥樹”之稱。根據(jù)花色，槐樹可分為白、青、黃、金槐等4個(gè)類別。其中，金槐為綠色落葉喬木，開花期長(zhǎng)，是槐樹中的優(yōu)良品種，廣泛分布于廣西全州以及湖南永州、衡陽一帶?；泵诪槎箍浦参锘?Sophora japonica L.)的干燥花蕾及花[1]354，已經(jīng)被列在國(guó)家衛(wèi)生部第一批藥食同源名單中[2]。蘆丁(Rutin)別名蕓香苷，是槐米總黃酮中的主要活性成分，分子中含有許多酚羥基，為黃酮苷類化合物，是一種生物活性很強(qiáng)，廣泛應(yīng)用的臨床中藥，具有防止小血板聚集或抑制血栓形成，促進(jìn)細(xì)胞增生和具有抗炎、降血脂的等作用[3-4]。

槐米中蘆丁含量的高低是決定槐米品質(zhì)的重要指標(biāo)，也直接關(guān)系到槐米生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)文獻(xiàn)[5]研究結(jié)果顯示，金槐中蘆丁的含量可達(dá)25% 左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他3種。前人[6-7]對(duì)槐米蘆丁的純化方法主要有結(jié)晶法和大孔樹脂。結(jié)晶法存在耗時(shí)久，溶劑不環(huán)保的缺陷，而大孔樹脂純化法對(duì)蘆丁純化的效率較低，難以達(dá)到藥典要求。據(jù)相關(guān)研究[8-9]，聚酰胺樹脂可與黃酮類、酚類等富含酚羥基的化合物形成氫鍵而被吸附，故本試驗(yàn)擬采用聚酰胺樹脂層析法，結(jié)合高效液相法檢測(cè)，優(yōu)選出蘆丁最佳精制工藝路線，以期得到一種原料利用率高、工藝簡(jiǎn)單且成本低的金槐精制蘆丁的方法，為槐米資源的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)與綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金槐槐米：2016年產(chǎn)，永州錦溁金槐種植農(nóng)業(yè)合作社。對(duì)其進(jìn)行除雜45 ℃烘干后，粉粹，過40目篩，置自封袋中備用。粗品蘆丁(59.15%)以金槐槐米為原材料，實(shí)驗(yàn)室前期用酸提堿沉的方法提取得到[10]。

1.2 主要試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：純度99%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；

甲醇：色譜純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

冰醋酸、純化水、甲醇、乙醇、氫氧化鈣、硼砂等：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

層析聚酰胺樹脂：650型，山東西亞化學(xué)股份有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

回流提取器：FVSY-360型，北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司；

電子分析天平：JA3003型，上海舜宇恒平科學(xué)有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：WG-71型，天津市泰斯特儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000B型，鞏義市英峪高科儀器廠；

搖床：ZHWY-211B型，上海智城分析儀器制造有限公司；

高速多功能粉碎機(jī)：XY-100型，浙江省永康市松青五金廠；

高效液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 聚酰胺樹脂的預(yù)處理 將聚酰胺樹脂用95%乙醇浸泡3 d，不斷攪拌、適時(shí)振蕩，使其充分溶脹，除去氣泡及乙醇漂浮物后濕法裝入32 mm×490 mm層析柱中。繼用3倍體積95%的乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘?jiān)驑O少殘?jiān)鼮橹?。再依次?倍5%的NaOH水溶液沖洗、然后用蒸餾水洗至中性，其次用3倍體積4%的醋酸水溶液洗脫，最后再用蒸餾水洗脫至中性無醇味，備用[1]355。

1.4.2 蘆丁含量的測(cè)定 采用高效液相色譜法[1]355。色譜條件：色譜柱為CLC-BDS-C18(6.0 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.1%醋酸溶液(42∶58)；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)器UV；檢測(cè)波長(zhǎng)257 nm；進(jìn)樣量10 μL；標(biāo)準(zhǔn)品為蘆丁(1 mg/mL)。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱定蘆丁對(duì)照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加少量甲醇溶解，繼續(xù)加甲醇至刻度并搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取2.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣2，4，6，8，10 μL。以進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸擬合，得線性回歸方程。

1.4.5 粗蘆丁的提取 準(zhǔn)確稱取槐米粉末若干克，置于圓底燒瓶中，加入適量3%硼砂水，用飽和Ca(OH)2調(diào)節(jié)至pH為10，以液料比1∶16 (g/mL)回流微沸提取36 min，回流2次。合并提取液，溫度降到60 ℃左右用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.5，放置12 h，抽濾、干燥得蘆丁粗品，備用[8]。粗蘆丁純度經(jīng)高效液相測(cè)定含量為59.15%。

1.4.6 靜態(tài)試驗(yàn)

(1) 靜態(tài)吸附與解吸附試驗(yàn)：精確稱取預(yù)處理好的3種不同目數(shù)的(30～60，60～100，100～200目)聚酰胺樹脂各5.000 0 g (干重)，分別置于250 mL三角燒瓶中，加入50 mL 的樣品蘆丁提取液，使溶液濃度為5 mg/mL， 于搖床上振蕩24 h，充分吸附后，吸取濾液1.0 mL，用高效液相測(cè)其在257 nm 下的峰面積A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中，測(cè)定吸附后的濾液蘆丁的質(zhì)量濃度。用去離子水將濾出的聚酰胺樹脂表面的殘留提取液洗去，然后分別另置于250 mL三角燒瓶中，加入70%的乙醇50 mL，置搖床中振蕩24 h，待充分解吸后立刻過濾，同法測(cè)其質(zhì)量濃度。計(jì)算3種不同目數(shù)的聚酰胺樹脂對(duì)金槐蘆丁的靜態(tài)吸附量、解吸率。

(2) 靜態(tài)吸附與解吸附動(dòng)力學(xué)：精確稱取處理好的3種不同目數(shù)(30～60，60～100，100～200目)聚酰胺樹脂各5.000 0 g(干重)，分別置于250 mL三角燒瓶中，精密加入50 mL 提取液，使溶液濃度為5 mg/mL，置搖床上振蕩，每隔30 min 取上清液1.0 mL，并測(cè)定其蘆丁濃度，繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。利用上述充分飽和吸附的樹脂，用蒸餾水沖洗其殘留的蘆丁提取液，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液50 mL，置于搖床上振蕩，每隔30 min 取上清液1.0 mL 并測(cè)定其蘆丁濃度，繪制解吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.4.7 動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

(1) 上樣濃度考察：精確稱取蘆丁粗品0.100 0 g，加50 mL 蒸餾水加熱使其充分溶解，均分5份，每份10 mL，再分別加蒸餾水50，60，70，80，90 mL得到不同質(zhì)量濃度的樣品液，濃度分別為0.333，0.286，0.250，0.222，0.200 mg/mL。精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂5份，濕法上柱，去離子水洗至無醇味?？刂茦悠芬毫魉贋?.0 mL/min，30 mL上樣。收集柱液，并測(cè)其蘆丁質(zhì)量濃度，繪制吸附量與上樣濃度關(guān)系曲線，確定最佳上樣濃度。

(2) 上樣流速考察：精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂5份，濕法上柱，去離子水洗至無醇味。用最佳上樣濃度上樣，樣品液30 mL過柱，控制流速分別為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL/min通過樹脂柱，收集流出的柱液，測(cè)其蘆丁質(zhì)量濃度。繪制吸附量與上樣流速關(guān)系曲線，確定最佳上樣流速。

(3) 吸附泄露曲線：精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂，濕法上柱，去離子水洗至無醇味。用確定的最佳上樣濃度和最佳上樣流速，每30 mL持續(xù)上樣，過柱。每10 mL(1 BV)收集為一管，測(cè)定其總蘆丁含量，并繪制吸附泄露曲線。

(4) 洗脫劑濃度考察：精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂5份，濕法上柱，去離子水洗至無醇味。用最佳上樣濃度、上樣流速及30 mL過柱。待吸附完全飽和后，分別用50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液各30 mL 進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測(cè)定解吸液中蘆丁質(zhì)量濃度。

(5) 洗脫劑體積考察:精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂5份，濕法上柱，去離子水洗至無醇味。樣品液按最佳條件上柱，待吸附完全后，用最佳洗脫劑進(jìn)行洗脫，每5 mL(0.5 BV)收集一管，收集18管，并測(cè)定每管中蘆丁的質(zhì)量濃度，繪制洗脫曲線，確定洗脫劑最佳用量。

1.4.8 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 精確稱取5.000 0 g(干重)聚酰胺樹脂，粗蘆丁提取液以最佳上樣濃度、上樣流速、上樣量上柱，流出的柱液再重新上柱一次，待充分吸附后，最后用最佳洗脫柱體積的最佳濃度洗脫液進(jìn)行洗脫，并如此重復(fù)3次試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)品與粗品的HPLC色譜圖見圖1、2。

由圖1、2可知，金槐槐米的蘆丁粗品與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在同一時(shí)間出峰，且峰型較好，故可認(rèn)為該峰是蘆丁的色譜峰。理論塔板數(shù)均>10 000，二者的分離度>1.5，符合藥典要求[1]355。粗品純度為59.15%。標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程為：y=2 142 221x-61 283(R2=0.999 9)，結(jié)果表明，蘆丁在2～10 μg 內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 靜態(tài)試驗(yàn)

3種樹脂的吸附量與解吸率見表1。

由表1可知，100～200目聚酰胺樹脂的吸附量為28.00 mg/g，解吸率為82.94%，較60～100與30～60目聚酰胺樹脂的都高。推測(cè)原因可能是不同目數(shù)的聚酰胺樹脂密度不同，與蘆丁的接觸面積不一樣，對(duì)蘆丁的吸附能力不同，解吸能力也不同[11-13]。綜上選取100～200目的聚酰胺樹脂進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

圖2 蘆丁粗品的HPLC圖

Table1 Adsorption capacity and desorption of different kinds of polyamide resin

樹脂650型/目吸附量/(mg·g-1)解吸率/%30～6020.0449.1460～10022.1074.12100～20028.0082.94

工業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中，生產(chǎn)效率與樹脂的動(dòng)力學(xué)特性密切相關(guān)，適合的聚酰胺樹脂不僅要有較高的吸附量和解吸率，還要具備較快的吸附和解吸附速度[14-15]。

2.2.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)結(jié)果分析 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線見圖3。

由圖3可知，30～60目的聚酰胺樹脂對(duì)蘆丁的吸附效果隨時(shí)間的變化不明顯，屬于慢速平衡型。60～100目和100～200目的聚酰胺樹脂均屬于快速平衡型，60～100目的聚酰胺樹脂在0.0～2.0 h階段，對(duì)蘆丁的吸附效果變化不明顯，而在2.0 h之后，吸附效果變化較為明顯；100～200目的聚酰胺樹脂對(duì)蘆丁的吸附效果隨著時(shí)間的變化顯著，比同時(shí)間下的60～100，30～60目聚酰胺樹脂的吸附速度都快，且吸附量也高，約3.0 h吸附完全。推測(cè)可能是100～200目的聚酰胺樹脂密度比30～60，60～100目的大，與蘆丁的接觸面積也相對(duì)較大，蘆丁又屬于黃酮苷類化合物，所含酚羥基較多，因而與之形成的氫鍵也較多，易被吸附。

圖3 靜態(tài)吸附動(dòng)力曲線

2.2.2 靜態(tài)解吸附動(dòng)力學(xué)結(jié)果分析 靜態(tài)解吸附動(dòng)力學(xué)曲線見圖4。

圖4 靜態(tài)解吸動(dòng)力曲線

由圖4可知，30～60目和60～100目聚酰胺樹脂隨時(shí)間的推移，解吸速度均變化不大，相對(duì)平穩(wěn)且解吸量不高。100～200目樹脂較其他2種樹脂解吸效果明顯，解吸量高，約3.0 h解吸完全。分析原因可能是不同吸附時(shí)間，不同吸附樹脂的飽和解吸量可能相同，物理化學(xué)性能不同，解吸動(dòng)力學(xué)也有所差異[14-16]。綜上試驗(yàn)結(jié)果，最終選擇100～200目聚酰胺樹脂對(duì)永州金槐中蘆丁進(jìn)行后續(xù)動(dòng)態(tài)吸附解吸性能研究。

2.3 動(dòng)態(tài)試驗(yàn)

2.3.1 上樣濃度的確定 由圖5可知，上樣濃度為0.200～0.286 mg/mL時(shí)，樹脂對(duì)蘆丁的吸附量呈上升趨勢(shì)；當(dāng)上樣濃度為0.286 mg/mL時(shí)，吸附量達(dá)到最大，隨后樹脂對(duì)蘆丁的吸附量隨上樣濃度的上升呈下降趨勢(shì)。可能是樣品液濃度過大，會(huì)在層析柱樹脂上端口沉積，導(dǎo)致部分樣品液不能被樹脂吸附分離；濃度過低，成分在樹脂中跑地較快，導(dǎo)致蘆丁成分來不及被吸附就已流出層析柱，從而影響純化效果準(zhǔn)確性[17-19]。達(dá)到最大吸附量后又隨上樣濃度的上升而下降，這是由于上樣濃度過高，導(dǎo)致泄露點(diǎn)提前，吸附量下降。因此，上樣濃度控制在0.286 mg/mL。

圖5 上樣濃度對(duì)蘆丁吸附量的影響

2.3.2 上樣流速的確定 由圖6可知，隨著上樣流速的不同，聚酰胺樹脂對(duì)其的吸附程度有明顯區(qū)別。當(dāng)上樣流速為4.0～1.0 mL/min 時(shí)，樹脂對(duì)蘆丁的吸附效果變化較大，當(dāng)上樣流速為1.0 mL/min 之后，流出液中的蘆丁含量降低，幾乎接近于完全被吸附。蘆丁在1.0，0.5 mL/min吸附量相差不大，同時(shí)考慮到時(shí)間等控制，提高分離速率和生產(chǎn)效率，最終選1.0 mL/min作為最佳的上樣流速。

圖6 上樣流速對(duì)蘆丁吸附量的影響

2.3.3 吸附泄露曲線 當(dāng)上樣量過載時(shí)，蘆丁出現(xiàn)泄漏[20]。由圖7可知，隨著粗蘆丁提取液上樣體積的增加，當(dāng)收集到第11流份時(shí)，流出液中蘆丁的含量逐漸增加，說明樹脂對(duì)蘆丁的吸附開始出現(xiàn)泄漏。當(dāng)收集到第14流份以后，流出液中總蘆丁的含量隨粗蘆丁提取液上樣體積的增加趨于平緩，說明此流份開始蘆丁已明顯泄露，并接近于飽和吸附，此時(shí)聚酰胺樹脂對(duì)蘆丁的飽和吸附量為28.00 mg/g。

2.3.4 洗脫劑濃度的確定 如圖8所示，聚酰胺樹脂對(duì)蘆丁的解吸量隨著乙醇濃度的升高先增長(zhǎng)后降低，在80%以下解吸量隨著乙醇的濃度增加而增高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%以上時(shí)，樹脂對(duì)蘆丁的吸附量變化趨于平穩(wěn)。可能是槐米中蘆丁在乙醇濃度為80%以下時(shí)溶解較少，因此解吸量較低；而隨著乙醇濃度>80%以后解吸量降低，可能是蘆丁溶液極性減小，蘆丁作為黃酮苷類化合物的溶解度反而降低。且從節(jié)省洗脫溶劑等方面考慮，選80%的乙醇作為洗脫溶劑。

圖7 吸附泄露曲線圖

圖8 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸量的影響

2.3.5 洗脫劑體積的確定 用洗脫劑對(duì)蘆丁進(jìn)行洗脫解吸時(shí)，用量過少，被吸附成分洗脫不完全；用量過多，則會(huì)造成溶劑浪費(fèi)，且對(duì)后續(xù)處理造成不便[20-23]。由圖9可知，聚酰胺樹脂對(duì)蘆丁的解吸量隨著洗脫體積的增加，呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)洗脫至第5流份后，樹脂對(duì)蘆丁的解吸量變化趨于平緩，表明此時(shí)蘆丁成分幾乎已被完全洗脫，以2個(gè)流份為1個(gè)柱體積，即以洗脫體積2.5 BV (柱體積)，可將絕大部分的蘆丁成分洗脫下來。因此，選擇2.5 BV為最佳洗脫體積。

綜合動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果可得出，聚酰胺樹脂純化金槐蘆丁的最佳工藝參數(shù)為：上樣濃度0.286 mg/mL、上樣流速1.0 mL/min、最大上樣量28.00 mg/g、洗脫劑為80%乙醇、洗脫劑用量2.5 BV。

圖9 金槐蘆丁洗脫曲線

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表2可知，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)平均得率55%，純度均達(dá)99%以上，RSD<2%，說明該分離純化工藝可行。

表2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過聚酰胺樹脂層析法對(duì)金槐蘆丁進(jìn)行純化，靜態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明，100～200目聚酰胺樹脂更適宜金槐蘆丁的純化，飽和吸附量為28.00 mg/g，解吸率為82.94%；動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明，聚酰胺法純化蘆丁的最佳工藝參數(shù)為：上樣濃度0.286 mg/mL，上樣流速1.0 mL/min，最大上樣量28.00 mg/g，洗脫劑為80%乙醇，洗脫劑用量2.5 BV。該工藝條件下蘆丁得率為55.49%，純度達(dá)到99%，且方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品符合歐洲藥典要求，但工藝路線仍處于實(shí)驗(yàn)階段，要進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)仍需要進(jìn)行放大試驗(yàn)數(shù)據(jù)的探索。