鰱魚酶解物對(duì)凍融魚糜制品品質(zhì)及其蛋白質(zhì)體外消化率的影響

劉永樂田苗苗李向紅俞 健王發(fā)祥王建輝黃軼群

LIU Yong-le1,2 TIAN Miao-miao1,2 LI Xiang-hong1,2 YU Jian1,2 WANG Fa-xiang1,2 WANG Jian-hui1,2 HUANG Yi-qun1,2

(1. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程系，湖南 長(zhǎng)沙 410114；2. 湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410114)

(1. Department of Food and Biological Engineering, School of Chemistry and Biological Engineering, Changsha University of Science & Technology, Changsha, Hunan 410114, China; 2. Hunan Provincial Engineering Technology Research Center of Aquatic Food Resources Processing, Changsha, Hunan 410114, China)

中國(guó)淡水魚產(chǎn)量居世界首位，2016 年，淡水魚總產(chǎn)量達(dá)2 815.54萬(wàn)t[1]。但是，淡水魚土腥味重、肌間刺多、貯運(yùn)加工過程中蛋白質(zhì)容易冷凍變性等，導(dǎo)致貯藏保鮮難、加工率低。目前，將淡水魚加工成冷凍魚糜及制品是淡水魚深加工及提高其加工率的重要途徑。鰱魚為中國(guó)四大家魚之一，2017年產(chǎn)量達(dá)450.66 萬(wàn)t，僅次于草魚[1]，是中國(guó)冷凍魚糜加工的主要淡水魚品種。

防止魚肉蛋白質(zhì)冷凍變性是冷凍魚糜儲(chǔ)運(yùn)及加工過程重點(diǎn)關(guān)注的課題。魚肉蛋白質(zhì)的主要組分——肌原纖維蛋白在凍結(jié)或凍藏過程中冰晶的形成會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)極性基團(tuán)周圍的水化層破壞，蛋白質(zhì)變性(折疊展開或聚集)及功能喪失，導(dǎo)致魚糜產(chǎn)品凝膠強(qiáng)度下降；長(zhǎng)期凍藏導(dǎo)致魚糜色澤發(fā)暗、持水力下降、凝膠強(qiáng)度降低、口感和風(fēng)味劣化[2-3]。工業(yè)上冷凍魚糜生產(chǎn)中多選用糖類(如蔗糖和/或糖醇)作為抗凍劑緩解蛋白質(zhì)冷凍變性[4]，然而糖類抗凍劑會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品帶有明顯甜味，熱量值增加，對(duì)消費(fèi)者吸引力下降。

包括本課題組的一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)魚的酶解產(chǎn)物是一種潛在的新型抗凍保護(hù)劑，能有效防止魚糜及其制品在凍藏過程中的凝膠結(jié)構(gòu)劣變[5]；而且魚酶解產(chǎn)物兼具較好的抗氧化性[6-7]，能防止魚糜制品的氧化劣變。Cheung等[8]研究也發(fā)現(xiàn)冷凍魚糜中添加太平洋鱈魚酶解產(chǎn)物后，相比添加商業(yè)抗凍劑，其壓榨失水率(Expressible moisture)和蒸煮損失(Cooking loss)降低，凍藏對(duì)魚糜食用品質(zhì)的影響有所緩解。相較于糖類抗凍劑，魚類酶解產(chǎn)物用于冷凍魚糜加工中可避免甜味的產(chǎn)生；其豐富的游離氨基酸、短肽等可增加產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

迄今為止，關(guān)于鰱魚酶解產(chǎn)物對(duì)冷凍魚糜及制品食用品質(zhì)的影響研究尚未見諸于報(bào)道，因此，在課題組前期研究的基礎(chǔ)上[5]，本研究擬選擇復(fù)合蛋白酶水解鰱魚制備抗凍效果最佳的酶解產(chǎn)物組，綜合評(píng)價(jià)添加不同量鰱魚酶解產(chǎn)物的魚糜制品凍融前后食用品質(zhì)(蒸煮損失、凝膠強(qiáng)度、全質(zhì)構(gòu)、白度、持水性)及蛋白質(zhì)體外消化率等的變化，旨在為鰱魚酶解產(chǎn)物在工業(yè)上應(yīng)用于冷凍魚糜及其制品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮白鰱魚：購(gòu)于長(zhǎng)沙理工大學(xué)高云市場(chǎng)；

復(fù)合蛋白酶：1.2×105U/g，丹麥諾維信公司；

腸衣：直徑50 mm，食品級(jí)塑料透明腸衣，河北省保定市順平縣唯新腸衣有限公司；

氫氧化鈉、硫酸銅等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：BL-9205B型，日本島津公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-2102PC型，上海棱普儀器儀表廠；

生物酶反應(yīng)器：100 M型，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；

冷凍干燥機(jī)：SCICENTZ-10NS型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

低速臺(tái)式大容量多管離心機(jī)：TDL-36C型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

恒溫水浴鍋：DK-98-Ⅱ型，天津泰斯特儀器有限公司；

通用臺(tái)式馬弗爐：ZY328004型，美國(guó)Thermo公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TA·XTplus型，英國(guó)Stable Mico System公司；

電子鼻：PEN3型便攜式，德國(guó)AIRSENSE公司；

測(cè)色色差計(jì)：WSC-S型，上海物理光學(xué)儀器廠；

手持均質(zhì)機(jī)：DS-1型，上海標(biāo)本模型廠；

1.2 方法

1.2.1 酶解產(chǎn)物的制備 課題組[5]前期研究發(fā)現(xiàn)，鰱魚采用復(fù)合蛋白酶水解30 min獲得的酶解產(chǎn)物抗凍效果較佳，因此本試驗(yàn)根據(jù)前期獲得的最優(yōu)條件制備了酶解產(chǎn)物，具體方法如下：

新鮮魚肉→去鱗、頭尾內(nèi)臟及骨刺→切塊、絞碎→稱取碎肉→加蒸餾水[料液比1∶5 (g/mL)]→充分分散→加復(fù)合蛋白酶酶解30 min(恒定溫度50 ℃、pH 值6.7)→滅酶(80 ℃，15 min)→冷卻至室溫→離心→上清液冷凍干燥→酶解產(chǎn)物

1.2.2 酶解產(chǎn)物常規(guī)成分的檢測(cè)

(1) 蛋白質(zhì)的測(cè)定：凱氏定氮法[9]。

(2) 水分的測(cè)定：直接干燥法[10]。

(3) 灰分的測(cè)定：干法灰化法[11]。

1.2.3 魚糜制品的制備 新鮮鰱魚在低于4 ℃環(huán)境中剔除魚骨魚皮魚刺，白肉用4 ℃蒸餾水沖洗，切成小塊斬拌5 min，在0～10 ℃下加入2.5%食鹽，2%淀粉斬拌5 min，然后分別添加不同量酶解產(chǎn)物(0%，2%，4%，6%)和商抗至魚糜中，在10 ℃以下斬拌混勻5 min后灌腸成型。成型后一組進(jìn)行凍融循環(huán)，一組進(jìn)行凝膠化處理，凝膠化處理：40 ℃水浴鍋保持30 min后90 ℃蒸煮20 min，冷卻后置于4 ℃條件冷藏過夜后測(cè)量；凍融循環(huán)組在6次凍融循環(huán)后凝膠處理，方法如上。上述試驗(yàn)過程重復(fù)3次。

2.1 確立項(xiàng)目 在項(xiàng)目學(xué)習(xí)中，第一步是要確定項(xiàng)目(課題)?！岸肌睆?fù)習(xí)中項(xiàng)目的確定應(yīng)該根據(jù)課程標(biāo)準(zhǔn)、《浙江省普通高中學(xué)科教學(xué)指導(dǎo)意見·生物》和《浙江省普通高中學(xué)業(yè)水平考試暨高考選考科目考試標(biāo)準(zhǔn)(2014版)》，以及教學(xué)內(nèi)容和學(xué)生已有的知識(shí)及經(jīng)驗(yàn)。項(xiàng)目可以是環(huán)境保護(hù)、人體健康等方面密切相關(guān)的社會(huì)性議題，也可以是學(xué)生身邊需要解決的生活和生產(chǎn)實(shí)踐問題。在確定項(xiàng)目時(shí)，該項(xiàng)目是否包含了生物學(xué)主干知識(shí)，是否涵蓋了學(xué)科核心素養(yǎng)，是否貼近學(xué)生的生活，是否來(lái)源于社會(huì)生產(chǎn)實(shí)踐，是否真實(shí)且有意義，學(xué)生是否感興趣，是否具有可操作性等，都是需要考慮的問題(圖1)。

1.2.4 蒸煮損失 根據(jù)Yang等[12]的方法略做修改，將魚糜凝膠切成凝膠圓柱體并稱重后放入蒸煮袋內(nèi)且封口，置90 ℃ 水浴鍋蒸煮20 min。蒸煮結(jié)束擦干水分后稱重。蒸煮損失按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

CL——蒸煮損失，%；

G1——樣品蒸煮前的質(zhì)量，g；

G2——樣品蒸煮后的質(zhì)量，g。

1.2.5 持水性測(cè)定 將樣品切成圓柱，稱其質(zhì)量，用濾紙包裹于離心管中，3 000 r/min離心10 min后稱重。持水率按式(2)計(jì)算[13]：

(2)

式中：

WH——持水率，%；

m1——樣品離心前的質(zhì)量，g；

m2——樣品離心后的質(zhì)量，g。

1.2.6 白度測(cè)定 用色差計(jì)測(cè)定樣品L*、a*、b*值。每組測(cè)量重復(fù)5次以上。白度(whiteness，W)按式(3)計(jì)算[14]：

(3)

1.2.7 魚糜制品凝膠強(qiáng)度的測(cè)定 將魚糜制品切成圓柱體，用質(zhì)構(gòu)分析儀分析其凝膠強(qiáng)度。設(shè)定參數(shù)：探頭P/0.5，測(cè)前速度0.5 mm/s，測(cè)中速度1 mm/s，測(cè)后速度為10 mm/s，測(cè)量距離6 mm，觸發(fā)力5 g，每組測(cè)量重復(fù)5次以上，結(jié)果取平均值[15]。

1.2.8 魚糜制品的全質(zhì)構(gòu)分析 取制備的凍融魚糜制品，室溫下恒溫2 h，切成直徑3 cm、厚度2 cm的圓柱體，采用質(zhì)構(gòu)儀的TPA模型在室溫下對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，每組平行測(cè)定5次。設(shè)定參數(shù)：探頭P/36R，測(cè)前速度3 mm/s，測(cè)試速度1 mm/s，測(cè)后速度3 mm/s，形變50%，觸發(fā)力5 g。

1.2.9 蛋白質(zhì)消化率

(1) 體外模擬消化試驗(yàn)：參照Wen等[16]和Escudero等[17]的方法測(cè)定蛋白質(zhì)體外消化率。稱取1.0 g 絞碎樣品，加入4 mL磷酸緩沖液，冰浴狀態(tài)下8 000 r/min重復(fù)2次勻漿，每次30 s；13 400 r/min重復(fù)2次勻漿，每次30 s，勻漿間隔30 s。1 mol/L HCl調(diào)節(jié)體系pH值為2.0±0.1，加入1 mL 胃蛋白酶溶液(0.48 g∶15 mL 0.1 mol/L HCl)，置于搖床上反應(yīng)(37 ℃，反應(yīng)時(shí)間2 h)。用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH值為7.5±0.1，加入1.0 mL胰蛋白酶溶液(0.288 g∶12 mL 0.01 mol/L pH值7.0的磷酸鹽緩沖液)，置于搖床勻速搖晃反應(yīng)(37 ℃，反應(yīng)時(shí)間2 h)；沸水浴處理10 min 終止酶解反應(yīng)。

(2) 蛋白質(zhì)消化率的測(cè)定：按上述消化過程將兩步消化后的酶解液加入無(wú)水乙醇靜置12 h沉淀蛋白，離心15 min，棄去上清液，沉淀在50 ℃烘干至恒重。按式(4)計(jì)算消化率[18]。

(4)

式中：

DT——消化率，%；

W0——表示消化前樣品中蛋白質(zhì)含量，g；

W1——表示消化后烘干沉淀物中蛋白質(zhì)含量，g。

1.2.10 感官評(píng)定 感官評(píng)定采用評(píng)分法，若干品評(píng)員針對(duì)滋味、組織狀態(tài)、彈性和口感四方面進(jìn)行評(píng)分，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1(滿分20分)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱魚酶解產(chǎn)物常規(guī)成分分析

由表2可知，鰱魚酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量比較豐富，含量達(dá)到了85%。

2.2 魚糜制品蒸煮損失和持水性變化

蒸煮損失指魚糜在蒸煮過程中的損耗，持水性是魚糜凝膠保留水分的能力，兩者顯示不同情況下凝膠對(duì)水分的持有能力。魚糜凝膠結(jié)構(gòu)越緊密，蒸煮損失越小，持水性越大[19]。

由圖1可知：凍融前后加入酶解產(chǎn)物，魚糜制品的蒸煮損失均降低，持水性均增加，添加酶解產(chǎn)物后降低蒸煮損失和提高持水性的原因是酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的吸濕性，可以增強(qiáng)魚糜對(duì)水分的吸收；此外，前期研究發(fā)現(xiàn)，該鰱魚酶解產(chǎn)物中天冬氨酸、谷氨酸和賴氨酸含量相比原料有所升高，這些氨基酸具有與自由水相互作用及優(yōu)先使易受攻擊的蛋白質(zhì)水合的能力[5]，從而增強(qiáng)了魚糜凝膠持水性，降低了蒸煮損失[20]。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

表2 鰱魚酶解產(chǎn)物的常規(guī)成分含量

酶解產(chǎn)物加入量為2%時(shí)，其抑制蒸煮損失和增加持水性方面略優(yōu)于4%和6%酶解產(chǎn)物添加組的，且2%酶解產(chǎn)物組與商抗組差異不顯著(P>0.05)。凍融前后2%酶解產(chǎn)物添加組蒸煮損失與空白組相比，分別降低了37.20%和43.40%；凍融前后的持水率與空白組相比，分別增加了0.93% 和2.20%。其原因可能是酶解后產(chǎn)生了較多分子量較低的酶解產(chǎn)物組分及游離氨基酸[21]，一方面這些物質(zhì)通過氫鍵等與魚糜肌原纖維蛋白相互作用對(duì)其有抗凍保護(hù)作用，另一方面高濃度小分子物質(zhì)的添加可能阻礙了肌原纖維蛋白形成穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而使得4%和6%酶解產(chǎn)物添加組的蒸煮損失增加、持水性降低。

2.3 魚糜制品色澤的變化

魚糜冷凍貯藏過程中，由于蛋白質(zhì)變性造成魚糜亮度降低，脂肪氧化產(chǎn)生的自由基等中間代謝產(chǎn)物則導(dǎo)致魚糜色素降解、褐變等。如圖2所示，凍融處理后所有樣品的白度值都有所降低，但商抗添加組的白度值變化不明顯(P>0.05)，而凍融處理后2%酶解產(chǎn)物組和商抗組的差異并不顯著(P>0.05)，說明酶解產(chǎn)物具有的抗凍性[5]和抗氧化性[7]，在凍融過程對(duì)于魚糜制品色澤的劣變有抑制作用；由于鰱魚酶解產(chǎn)物本身呈現(xiàn)淡黃色，4%和6%酶解產(chǎn)物添加組凍融前后隨著其添加量越大，魚糜的白度值越低。

不同小寫字母表示不同試驗(yàn)組之間差異顯著(P<0.05)

2.4 魚糜制品凝膠強(qiáng)度的變化

凝膠強(qiáng)度是判斷魚糜品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)，對(duì)魚糜制品的口感等品質(zhì)及價(jià)格有決定性作用[22]，而魚糜凝膠強(qiáng)度取決于肌原纖維蛋白組成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度。通過測(cè)定凍融前魚糜制品的凝膠強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)(圖3)，凍融后，每組樣品的凝膠強(qiáng)度都有所降低，凍融過程中肌原纖維蛋白的變性造成了凝膠強(qiáng)度的降低，但2%酶解產(chǎn)物添加組的凝膠強(qiáng)度明顯高于空白組的(P<0.05)，添加6%酶解產(chǎn)物后反而降低了魚糜制品的凝膠強(qiáng)度，說明適量的鰱魚酶解產(chǎn)物可提高魚糜制品的凝膠強(qiáng)度；2%酶解產(chǎn)物組與商抗添加組的凝膠強(qiáng)度差異不顯著(P>0.05)。酶解產(chǎn)物可能與冷凍時(shí)形成的冰晶結(jié)合，阻止冰晶進(jìn)一步變大，保護(hù)了肌原纖維蛋白因冰晶長(zhǎng)大而導(dǎo)致的變性[23]；酶解產(chǎn)物也可能與蛋白通過疏水相互作用、氫鍵等直接作用，在冷凍時(shí)對(duì)魚糜蛋白起到保護(hù)作用[24]。

2.5 魚糜制品的全質(zhì)構(gòu)分析

魚糜制品的全質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果見表3。結(jié)果表明，凍融過程中，肌原纖維蛋白一定程度的變性導(dǎo)致魚糜品質(zhì)有所降低；但凍融后2%，4%酶解產(chǎn)物添加組和商抗添加組的硬度、彈性、內(nèi)聚性回復(fù)性均明顯優(yōu)于空白組的，表明一定濃度的酶解產(chǎn)物及商業(yè)抗凍劑對(duì)魚糜制品的凝膠品質(zhì)具有較好的保護(hù)效果。

2.6 蛋白質(zhì)消化率的變化

蛋白質(zhì)消化率是反應(yīng)蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)分解的指標(biāo)，是評(píng)價(jià)食物蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一[24]。如圖4所示，凍融后各組的蛋白質(zhì)消化率均有所下降，空白組蛋白質(zhì)消化率下降了55.44%，而2%酶解產(chǎn)物添加組的蛋白質(zhì)消化率在凍融后略高于商抗組的，下降程度為47.02%，與空白組差異顯著(P<0.05)。凍融后蛋白質(zhì)消化率的降低，可能與蛋白質(zhì)冷凍變性的機(jī)理有關(guān)。主流觀點(diǎn)認(rèn)為，凍結(jié)或凍藏過程中冰晶的形成引起蛋白質(zhì)極性基團(tuán)周圍的水化層被破壞，導(dǎo)致肌原纖維蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)改變(如折疊展開或聚集)和功能喪失[2-3]。理論上來(lái)說，蛋白質(zhì)展開有利于蛋白質(zhì)消化酶和底物的接觸，從而有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)消化率的增加，本研究中，各組蛋白質(zhì)消化率均下降，說明在魚糜制品中蛋白質(zhì)的變性遵循的可能是變性展開再聚集的途徑，酶解產(chǎn)物的添加降低了肌原纖維蛋白的變性程度，從而減少了其消化率的下降程度。

表3 魚糜產(chǎn)品全質(zhì)構(gòu)分析?

? 同列不同小寫字母表示不同試驗(yàn)組之間差異顯著(P<0.05)。

不同小寫字母表示不同試驗(yàn)組之間差異顯著(P<0.05)

2.7 魚糜制品的感官評(píng)定

感官評(píng)定進(jìn)一步表征了魚糜制品在凍融前后的食用品質(zhì)，結(jié)果見表4。凍融后魚糜制品感官評(píng)定評(píng)分都下降，凍融循環(huán)影響最大的是樣品的組織狀態(tài)(如圖5所示)，空白組和6%酶解產(chǎn)物添加組制品的橫截面呈海綿狀，從而導(dǎo)致彈性和口感均下降；酶解產(chǎn)物的加入對(duì)樣品滋味有一定的影響，過量會(huì)有異味，顏色偏黃；而商業(yè)抗凍劑的加入，導(dǎo)致產(chǎn)品有明顯的甜味，破壞了魚糜制品特有的魚香風(fēng)味；從感官評(píng)定結(jié)果可知2%酶解產(chǎn)物添加組在凍融前后得分均較高。

表4 魚糜制品的感官評(píng)定結(jié)果

3 結(jié)論

通過綜合對(duì)比添加了不同量鰱魚酶解產(chǎn)物(0%，2%，4%，6%)的魚糜制品凍融前后品質(zhì)(蒸煮損失、持水性、白度、凝膠強(qiáng)度、全質(zhì)構(gòu)及感官品質(zhì)等)及體外蛋白消化率的變化可知：魚糜制品中添加2%的酶解產(chǎn)物可以增加魚糜凝膠持水性，降低蒸煮損失，并且不會(huì)導(dǎo)致魚糜制品帶上酶解產(chǎn)物本身的淡黃色；同時(shí)，2%酶解產(chǎn)物添加組能有效減緩魚糜制品凝膠強(qiáng)度、硬度和彈性的降低及其蛋白質(zhì)消化率的下降程度；感官評(píng)定中2%酶解產(chǎn)物添加組在凍融前后均得分較高，酶解產(chǎn)物的添加避免了商抗給產(chǎn)品帶來(lái)的明顯甜味。該研究表明，鰱魚酶解產(chǎn)物可作為潛在的抗凍劑應(yīng)用于魚糜及其制品的工業(yè)化生產(chǎn)，但長(zhǎng)期凍藏過程中鰱魚酶解產(chǎn)物在魚糜及其制品中的抗凍性及其抗凍機(jī)理有待進(jìn)一步研究。