抑制受體相互作用蛋白1可改善慢性應(yīng)激小鼠的認(rèn)知功能損害*

段尚春 卿文祥 王雪琴 童建斌, 丁志剛△

(中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院,1 麻醉科,2 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,長(zhǎng)沙 410013)

慢性應(yīng)激嚴(yán)重威脅人類健康,與認(rèn)知功能損害、焦慮抑郁、反社會(huì)行為、高血壓病、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)等密切相關(guān)[1-3],慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激使得大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生慢性應(yīng)激損傷[4],神經(jīng)炎癥在其病理過(guò)程中起重要作用[4]。但至今抑制神經(jīng)炎癥防治慢性應(yīng)激導(dǎo)致的腦功能障礙仍無(wú)有效的方法。受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIP1)是一個(gè)多功能蛋白,能調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路、caspase-8依賴的凋亡通路、RIP1-RIP3-MLKL壞死復(fù)合體介導(dǎo)的程序性壞死通路[7]。近來(lái),Ofengeim等[8]報(bào)道,RIP1激活可使AD小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化增加;抑制其活性能改善AD小鼠神經(jīng)炎癥和行為缺陷。這表明抑制RIP1活性能抑制神經(jīng)炎癥。因此,本研究檢測(cè)抑制RIP1活性能否改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠腦功能障礙。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

72只健康的8周齡C57BL/6J雄性小鼠,由中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK(湘)2016-0002;倫理編號(hào)：LLSC(LA)2017-007)。房間條件為標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境(溫度22℃～25℃,濕度40%～60%,12h白天,12h夜晚),可自由飲水、攝食。72只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為以下4組(n=18)：正常對(duì)照組,無(wú)干預(yù);necrostatin-1(Nec-1)組腹腔注射溶于2.5% DMSO的Nec-1(Selleckchem,美國(guó))抑制RIP1活性,6.25mg/kg,每3d 注射1次;應(yīng)激DMSO組,進(jìn)行約束應(yīng)激2周,每3d注射1次2.5% 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),給藥體積同Nec-1;應(yīng)激Nec-1組,進(jìn)行約束應(yīng)激2周,每3d d天注射1次Nec-1。

1.2 慢性應(yīng)激動(dòng)物模型制備

每天18點(diǎn)進(jìn)動(dòng)物房將小鼠引入50ml四周打孔的離心管內(nèi)(水、食物剝奪,空間限制),并水平放置在原飼養(yǎng)籠內(nèi),次日9點(diǎn)釋放,持續(xù)2周[9]進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 曠場(chǎng)試驗(yàn)

行為學(xué)檢測(cè)于中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院行為檢測(cè)室完成,實(shí)驗(yàn)前小鼠置于行為室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境至少30min,每組10只小鼠。應(yīng)激結(jié)束當(dāng)天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn),19：00開(kāi)始測(cè)試。曠場(chǎng)為(50×50×40) cm底面分25個(gè)小格的木框,將小鼠置于曠場(chǎng)中間釋放,用攝像頭記錄5min內(nèi)小鼠的活動(dòng)距離,每只小鼠完成測(cè)試后清理大小便,75%乙醇擦拭去除氣味后再進(jìn)行下一只檢測(cè)。中央?yún)^(qū)時(shí)間百分比[10]=中間9格時(shí)間/總時(shí)間×100%。

1.4 新物體識(shí)別

應(yīng)激后第1～2d進(jìn)行新物體識(shí)別檢測(cè)。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)使用 (30×30×20) cm大小的箱子。首先將兩個(gè)完全相同的物品放入箱子內(nèi)對(duì)稱的位置,讓小鼠在箱子自由探索10min。24h之后,將其中1個(gè)物品換成另1個(gè)大小相近但顏色形狀完全不相同的物品。記錄小鼠10min內(nèi)對(duì)2個(gè)不同物體的探索時(shí)間,用辨別指數(shù)評(píng)價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)能力。辨別指數(shù)=新物體探索時(shí)間/(新物體探索時(shí)間+舊物體探索時(shí)間)[11]。

1.5 巴恩斯迷宮

應(yīng)激后第3～6d進(jìn)行巴恩斯迷宮訓(xùn)練。迷宮由直徑122cm的圓形平臺(tái)構(gòu)成,四周分布20個(gè)洞口,洞口直徑10cm。逃避盒放在其中1個(gè)洞口的底部。迷宮上方懸掛200W的白熾燈刺激作為驅(qū)動(dòng)小鼠進(jìn)入目標(biāo)洞口的動(dòng)機(jī)[12]。實(shí)驗(yàn)時(shí),小鼠置于圓形平臺(tái)的中央起始盒內(nèi),記錄其在180s內(nèi)找到正確洞口前的犯錯(cuò)次數(shù)和時(shí)間,共4d,每天測(cè)試3次,每次間隔20min。每次測(cè)試完畢后用75%乙醇紗布擦拭清洗,以防通過(guò)嗅覺(jué)找到目標(biāo)洞口。

1.6 免疫組織化學(xué)和免疫熒光顯色

2周約束應(yīng)激完成后,立刻取材。將取得的小鼠海馬組織用4%的多聚甲醛后固定24h,然后于15%蔗糖脫水1d,30%的蔗糖脫水2d,最后用組織膠包埋。將包埋好的組織切成20μm的薄片,加入5%的小牛血清,封閉1h,然后按一定比例加入一抗Iba1(Ms,Wako,1∶1500)、p-CREB(Rb,Abcam,1∶500)。一抗置于4℃冰箱過(guò)夜,分別加入DAB二抗和熒光二抗,室溫孵育2h。漂洗二抗,前者ABC液孵育1h,漂洗后DAB染色觀察結(jié)果,后者漂洗二抗貼片后熒光顯微鏡觀察結(jié)果(n=4)。

1.7 免疫印跡檢測(cè)

海馬組織加入蛋白裂解液NP40機(jī)械裂解,離心取上清,用BCA試劑盒(CWBio,中國(guó))進(jìn)行蛋白定量。每個(gè)樣品取等量蛋白,經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜后,按分子量剪取帶目的條帶的膜。TBST溶液漂洗,5%脫脂牛奶室溫封閉1h,一抗孵育(RIP1(Rb,CST,1∶200);RIP3、MLKL、NF-κB (Rb,CST,1∶1500))過(guò)夜。次日,膜用TBST溶液漂洗,熒光二抗孵育1h,漂洗后紅外線顯影觀察條帶。蛋白條帶通過(guò)使用Image J進(jìn)行光密度定量。目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平用靶蛋白的光密度值/同膜GAPDH的光密度值表示(n=4)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

使用TRIzol法提取組織中的總RNA,測(cè)完濃度后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(Genne Copoeia,AORT-0060)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,稀釋10倍后使用。PCR反應(yīng)體系為2×qPCR mix 10μl,引物2μl,水6μl,cDNA 2μl。反應(yīng)完成后根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量(n=4)。使用引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Nec-1改善小鼠認(rèn)知功能損害

通過(guò)曠場(chǎng)、新物體識(shí)別、巴恩斯迷宮3種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nec-1是否能夠改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)各個(gè)組之間5min走行總距離和中央?yún)^(qū)時(shí)間百分比沒(méi)有明顯差別(圖1B,P>0.05)。新物體識(shí)別測(cè)試各個(gè)組之間辨別指數(shù)也沒(méi)有明顯組間差異(圖1C,P>0.05)。而巴恩斯迷宮測(cè)試后(圖1D),重復(fù)測(cè)量方差分析顯示小鼠探索潛伏期(P<0.05)和犯錯(cuò)次數(shù)(P<0.01)都有明顯組間差異。多重比較顯示,對(duì)照組和Nec-1組探索目標(biāo)盒潛伏期沒(méi)有差別(P>0.05);與對(duì)照組相比,應(yīng)激DMSO組探索目標(biāo)盒的潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05);與應(yīng)激DMSO組比,應(yīng)激Nec-1組潛伏期明顯縮短(P<0.05)。此外,對(duì)照組與Nec-1組、應(yīng)激Nec-1組之間犯錯(cuò)次數(shù)沒(méi)有差異(P>0.05),而應(yīng)激DMSO組比對(duì)照組明顯增多(P<0.05);與應(yīng)激DMSO組比較,應(yīng)激Nec-1組犯錯(cuò)次數(shù)顯著降低(P<0.05)(圖1E)。以上研究表明,Nec-1能夠改善小鼠慢性應(yīng)激導(dǎo)致的空間記憶功能損害,而Nec-1本身不影響學(xué)習(xí)記憶。

圖1 抑制RIP1活性減輕了小鼠慢性應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害Fig 1 Inhibiting RIP1 by necrostatin-1 alleviated the brain dysfunction induced by chronic stress in miceA：Schedule of drug administration,restraint stress and behavior test;B：Open field test; C：The novel object recognition test;D：Barnes maze test.Data were presented as *P<0.05,n=10

2.2 Nec-1降低小鼠神經(jīng)炎癥

為了檢測(cè)神經(jīng)炎癥水平,對(duì)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)和炎癥因子mRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。與對(duì)照組相比,Nec-1組、應(yīng)激Nec-1組小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度無(wú)明顯差別,而應(yīng)激DMSO組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增加;與應(yīng)激DMSO組相比,應(yīng)激Nec-1組降低了小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度(圖2A)。通過(guò)qPCR檢測(cè)了海馬組織炎癥因子白介素-1α(interleukin 1 alpha,IL-1α),白介素-1β(interleukin 1 beta,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(圖2B),對(duì)照組與Nec-1組炎癥因子表達(dá)量沒(méi)有明顯差別(P>0.05);而應(yīng)激DMSO組炎癥因子水平明顯升高(IL-1α：P<0.05,IL-1β：P<0.01,TNF-α：P<0.05);而應(yīng)激Nec-1組較應(yīng)激DMSO組炎性因子水平顯著降低(IL-1α：P<0.01,IL-1β：P<0.01,TNF-α：P<0.05)。以上研究表明,抑制RIP1的活性,降低了慢性應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥水平。

2.3 Nec1抑制小鼠RIP1和NF-κB的上調(diào)

RIP1既能激活受體相互作用蛋白3(receptor interacting protein 3,RIP3)和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL),與之形成壞死復(fù)合物促進(jìn)程序性壞死,又能激發(fā)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor kappa B,NF-κB)依賴的炎癥通路。因此,通過(guò)蛋白免疫印跡檢測(cè)了海馬RIP1、RIP3、MLKL和NF-κB的表達(dá)。結(jié)果顯示(圖3A-D),與對(duì)照組相比,Nec-1組和應(yīng)激Nec-1組的RIP1和NF-κB表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);應(yīng)激DMSO組兩者表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。而與應(yīng)激DMSO組相比,應(yīng)激Nec-1組明顯降了RIP1和NF-κB的表達(dá)量(P<0.05,圖3A-B)。此外,RIP3(圖3C)和MLKL(圖3D)表達(dá)量在各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明,Nec-1通過(guò)降低RIP1的活性抑制了小鼠慢性應(yīng)激導(dǎo)致的RIP1和NF-κB的上調(diào)。

2.4 Nec-1對(duì)神經(jīng)可塑的作用

為了觀察Nec-1對(duì)神經(jīng)突觸可塑性的作用,對(duì)海馬N-甲基-D天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDA)亞基(NR2a、NR2b),α-氨基-3羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸鹽受體(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate receptor,AMPA)亞基(GluA1、GluA2)以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白磷酸化環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(Phosphorylated cyclic AMP response element binding protein,p-CREB)進(jìn)行了檢測(cè)。與對(duì)照組相比,Nec-1組海馬齒狀回p-CREB+細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有差別,而應(yīng)激DMSO組明顯減少;應(yīng)激Nec-1組較應(yīng)激DMSO組p-CREB+細(xì)胞明顯增加(圖4A)。與p-CREB+細(xì)胞表現(xiàn)一致,和對(duì)照組相比,Nec-1組GluA1的表達(dá)量沒(méi)有變化,應(yīng)激DMSO組卻顯著減少(P<0.05);與應(yīng)激DMSO組相比,應(yīng)激Nec-1組GluA1表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。各組之間NR2a、NR2b和GluA2表達(dá)量沒(méi)有明顯差別(P>0.05,圖4B)。這些結(jié)果說(shuō)明Nec-1抑制RIP1改善慢性應(yīng)激造成的某些突觸蛋白和p-CREB的丟失。

2.5 Nec-1對(duì)HPA軸的影響

檢測(cè)海馬鹽皮質(zhì)激素受體(mineralcorticoid receptor,MR)和糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)mRNA的表達(dá)量來(lái)探索Nec-1抑制RIP1活性對(duì)HPA軸的影響。結(jié)果表明,GR和MR在各組之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5,P>0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明抑制RIP1活性不影響HPA軸MR、GR的表達(dá)。

圖5 抑制RIP1活性對(duì)HPA軸的影響Fig 5 Effects of inhibiting RIP1 by Nec-1 on HPA axis There was no significant difference of MR and GR expession between groups.Data were showed as n=4,one-way ANOVA followed by Turkey’s post hoc comparisons tests

3 討論

本研究旨在探討用Nec-1抑制RIP1活性能否改善小鼠慢性應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害。本研究結(jié)果顯示,慢性應(yīng)激能夠?qū)е旅黠@的認(rèn)知功能損害、神經(jīng)炎癥水平升高、突觸蛋白受體GluA1和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白p-CREB的丟失。Nec-1抑制RIP1的活性后,能夠顯著改善應(yīng)激導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶損傷及其病理改變。這意味著調(diào)節(jié)RIP1可能是防治慢性應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害的潛在作用靶點(diǎn)。

慢性應(yīng)激帶來(lái)許多健康問(wèn)題,包括認(rèn)知功能損害、焦慮抑郁、反社會(huì)行為以及遲發(fā)的AD[13-14]。以往的研究表明,慢性應(yīng)激能夠使腦內(nèi)炎癥水平升高。阻斷炎癥介質(zhì)的釋放或抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化,都能減輕慢性應(yīng)激導(dǎo)致的腦功能損害[15]。這說(shuō)明在慢性應(yīng)激時(shí),抑制炎癥水平能減輕腦功能障礙。RIP1參與了NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路,caspase-8依賴的凋亡通路,以及RIP1-RIP3-MLKL壞死復(fù)合體依賴的程序性壞死通路[16],是調(diào)節(jié)炎癥、凋亡以及程序性壞死中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。作為RIP1特異性的抑制劑,Nec-1也在炎癥、凋亡以及程序性壞死中發(fā)揮著重要的作用,并且可以透過(guò)血腦屏障[17]。于是,本研究使用Nec-1抑制RIP1的活性,觀察它是否能改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害。結(jié)果表明,Nec-1不僅能夠改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害,還可以有效抑制應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥。下丘腦-垂體-腎上腺軸是主要的應(yīng)激軸,激活后可以釋放糖皮質(zhì)激素。過(guò)度應(yīng)激使糖皮質(zhì)激素進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),對(duì)腦組織有神經(jīng)毒性,而適度應(yīng)激有利于機(jī)體增強(qiáng)適應(yīng)能力。因此,不能以HPA軸為靶點(diǎn)來(lái)降低應(yīng)激導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害。與此觀點(diǎn)一致,本研究結(jié)果表明Nec-1不影響海馬組織與HPA軸相關(guān)的GR和MR表達(dá)。此外,Nec-1降低了RIP1和NF-κB的表達(dá),不影響RIP3和MLKL,這說(shuō)明Nec-1可能是通過(guò)NF-κB途徑限制了應(yīng)激導(dǎo)致的炎癥水平的升高。大量研究報(bào)道,慢性應(yīng)激與海馬NMDA受體、AMPAR受體以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白p-CREB密切相關(guān)[18-21]。GluA1在空間學(xué)習(xí)記憶的獲取、維持、再現(xiàn)等過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[22-23]?；蜣D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白p-CREB與長(zhǎng)程記憶的形成有關(guān),而神經(jīng)炎癥水平升高能使p-CREB減少和GluA1丟失[24-25]。與此一致的是,本研究顯示Nec-1能夠減少應(yīng)激導(dǎo)致的GluA1和p-CREB的丟失。

綜上所述,抑制RIP1活性可顯著改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠認(rèn)知功能損害及其病理改變,抑制神經(jīng)炎癥可能是其重要機(jī)制。因此,RIP1可能是改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的腦功能損傷的潛在靶點(diǎn)。