長鏈非編碼RNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本2在胃癌血清中的表達(dá)及臨床意義*

孫曉杰 郭紅艷 吳 琦 齊曉丹 徐 晶 黃常志 張春晶△

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院,1 臨床生化教研室,2 生物化學(xué)教研室,齊齊哈爾 161006;3 國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

長鏈非編碼RNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本2(colon cancer associated transcript 2,CCAT2)于2013年被發(fā)現(xiàn),該基因定位于人類染色體8q24.21[1]。研究表明,CCAT2具有癌基因的功能,其在人類結(jié)腸癌[2]、胃癌[3]、乳腺癌[4]及卵巢癌[5]等多種腫瘤組織中均表達(dá)增高,與腫瘤細(xì)胞的生長增殖和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。但CCAT2在腫瘤患者血清中是否表達(dá)以及血清表達(dá)水平與腫瘤臨床病理特征的相關(guān)性卻未見報(bào)道。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測了胃癌患者和健康對照者血清CCAT2的相對表達(dá)量,分析CCAT2的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性,初步探討CCAT2作為血清學(xué)診斷標(biāo)志物對胃癌的臨床診斷效能及意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究所用血清樣本包括胃癌患者117例和正常對照100例,均取自2017年3～6月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院住院的胃癌患者和健康體檢者。全部胃癌樣本在收集前均未進(jìn)行手術(shù)、放療和化療等相關(guān)治療,癌癥病例經(jīng)病理診斷證實(shí),根據(jù)手術(shù)結(jié)果按照美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)關(guān)于癌癥的腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis,TNM)分期系統(tǒng)第6版確定腫瘤分期。對于不適合手術(shù)治療的病例,病理診斷和腫瘤分期通過組織活檢及影像學(xué)檢查確定。本研究經(jīng)過中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理會(huì)批準(zhǔn),所有研究對象均已簽署知情同意書,相關(guān)臨床資料見表1。

表1 研究對象的臨床和人口學(xué)特征Tab 1 Clinical and demographic characteristics of subjects

GC: Gastric cancer

1.2 血清標(biāo)本收集

用血清收集管分別收集5ml胃癌和健康人靜脈血,室溫靜置1h后,用4℃離心機(jī)3500r/min離心10min。將上層血清轉(zhuǎn)移到新的收集管后,4℃ 16000r/min離心10min,以除去任何細(xì)胞碎片,-80℃保存。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

采用TRIzol LS試劑(Invitrogen公司,美國)從血清中提取總RNA,具體步驟按照試劑說明書進(jìn)行,取250μl血清,加入750μl TRIzol LS,室溫裂解后分別加入三氯甲烷、異丙醇以及75%乙醇等試劑提取總RNA,溶解于20μl的RNase free ddH2O,用紫外分光光度儀測定總RNA 的吸光度(A260/A280),比值在1.8～2.2的樣本經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(TaKaRa,日本)催化逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系為20μl,包含12μl模板RNA、2μl隨機(jī)引物、1μl dNTP、0.5μl 逆轉(zhuǎn)錄酶、0.5μl RNA酶抑制劑以及4μl緩沖溶液,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃ 60min,95℃ 5min。反應(yīng)生成的cDNA模板5倍稀釋后采用HieffTMqPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)試劑盒(翊圣生物科技公司,上海)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。PCR反應(yīng)體系總體積為20μl,PCR引物由Invitrogen公司合成,CCAT2上游引物：5′-CCCTGGTCAAAT TGCTTAACCT-3′,下游引物：5′-TTATTCGTCCC TCTGTTTTATGGAT-3′;GAPDH上游引物：5′-CC TGGTATGACAACGAATTTG-3′,下游引物：5′-CA GTGAGGGTCTCTCTCTTCC-3′。使用QuantStudioTM7 Flex 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI,美國)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s,95℃變性10s,60℃ 退火及延伸30s,40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.4 腫瘤標(biāo)志物的檢測

采用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(羅氏公司,瑞士)通過電化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定血清樣本中腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)、糖類抗原72-4(CA72-4)和甲胎蛋白(AFP)的表達(dá)量,檢測結(jié)果的上限值分別為5.0ng/ml、39U/ml、8.2U/ml和7.0ng/ml,腫瘤標(biāo)志物的檢測結(jié)果通過查閱臨床病例資料獲得。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CCAT2在胃癌血清中表達(dá)量增高

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,CCAT2在胃癌血清中的表達(dá)量為1.730±1.169,而在對照組健康人群血清中的表達(dá)量為1.280±0.845,平均增高1.352倍,2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖1)。

圖1 CCAT2在胃癌和正常對照組血清樣本中的差異表達(dá)Fig 1 Differential expression of CCAT2 in gastric cancer and controls

The expression of CCAT2 in the serum of 117 cases of gastric cancer (GC) and 100 healthy controls (normal),the results were repeated 3 times,the X-axis was grouped,and the Y-axis data was the logarithm of log2 after the corrected expression of internal reference GAPDH.

2.2 血清CCAT2的表達(dá)量與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性

根據(jù)胃癌患者的性別、年齡、TNM分期以及病理分化程度等分別進(jìn)行了對比分析,Mann-Whitney U檢驗(yàn)結(jié)果顯示,血清CCAT2的表達(dá)水平與年齡、性別、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及腫瘤臨床分期等均不相關(guān)(P>0.05),但其在低分化胃腺癌患者血清中的表達(dá)量卻明顯高于中分化胃腺癌患者(P<0.01,圖2)。

2.3 CCAT2的ROC曲線診斷性能

為了評估血清CCAT2對胃癌患者和正常對照組的診斷價(jià)值,首先利用SPSS 21統(tǒng)計(jì)軟件繪制ROC曲線,通過ROC曲線的敏感度和1-特異度值計(jì)算出約登指數(shù)(Youden’s index),最大約登指數(shù)對應(yīng)的值即為最佳預(yù)測值(cut off值)。經(jīng)計(jì)算確定最佳預(yù)測值為0.904,此時(shí)曲線下面積(AUC)為0.619(95%可信區(qū)間為0.544～0.694,P=0.002)(圖3)。以0.904為診斷閾值(即危險(xiǎn)分?jǐn)?shù)),將樣本劃分為兩組,即高危險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)組和低危險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)組,分別代表胃癌患者和健康人,進(jìn)行危險(xiǎn)分?jǐn)?shù)分析,結(jié)果診斷的陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為66.18%和67.95%。

2.4 血清樣本中CEA、CA19-9、CA72-4和AFP的表達(dá)量檢測

通過查閱病例,對胃癌組和正常對照組樣本的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA19-9、CA72-4以及AFP的檢測結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,Mann-Whitney U檢驗(yàn)結(jié)果顯示,胃癌組與對照組血清中AFP的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但血清CA19-9(P<0.01)、CEA(P<0.05)和CA72-4(P<0.01)的表達(dá)量明顯高于對照組,兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖2 CCAT2表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性Fig 2 Correlation between CCAT2 expression and clinicopathological characteristics of gastric cancerA-E：The expression level of CCAT2 in gastric cancer serum was not related to sex,age,lymph node metastasis (N),distant metastasis (M), and clinical stage (I to IV) according to the TNM staging;F：The expression level of CCAT2 was negatively correlated with tumor differentiation

圖3 CCAT2用于診斷胃癌的ROC曲線Fig 3 The ROC curve of CCAT2 for the diagnosis of gastric cancer

2.5 血清CCAT2診斷標(biāo)志物與CA19-9、CA72-4和CEA的比較

對血清表達(dá)量有顯著差異的CA19-9、CA72-4和CEA進(jìn)行了ROC曲線分析(圖5),結(jié)果顯示,CA19-9、CA72-4和CEA診斷胃癌的曲線下面積分別為0.624(95%可信區(qū)間為0.540～0.709)、0.727(95%可信區(qū)間為0.651～0.804)和0.604(95%可信區(qū)間為0.516～0.691)。三者對胃癌診斷的特異度分別為100%、82.47%和95.92%,但敏感度僅為10.81%、21.21%和17.33%,而同樣的病例,CCAT2診斷的特異度和敏感度分別為53.00%和78.63%(表2)。

表2 CCAT2與CA19-9、CA72-4和CEA診斷胃癌的敏感度和特異度比較Tab 2 Comparison of sensitivity and specificity between CCAT2 and CA19-9、 CA72-4 and CEA in the diagnosis of gastric cancer

3 討論

近年來長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用備受矚目。最近大量文獻(xiàn)報(bào)道,CCAT2參與多種人類腫瘤的進(jìn)程,如CCAT2可以被E2F1激活,并通過與PTTG1相互作用在垂體腺瘤中發(fā)揮致癌作用[6]。CCAT2高表達(dá)能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲行為[7];敲低lncRNA CCAT2可通過miR-216b抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[8];CCAT2過表達(dá)能明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲行為,而CCAT2基因沉默可通過PI3K/mTOR信號通路抑制胃癌細(xì)胞的生長增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[9-11]。作為一種具有致癌作用的lncRNA,CCAT2與多種腫

圖4 胃癌組和對照組血清腫瘤標(biāo)志物的檢測結(jié)果Fig 4 Detection of serum tumor markers in gastric cancer and control groups

瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等相關(guān),不僅是癌癥轉(zhuǎn)移及預(yù)后評估的新的生物標(biāo)志物,而且可能成為癌癥臨床治療的靶點(diǎn)[12-13]。

本研究通過血清學(xué)檢測顯示,CCAT2在胃癌患者血清中的表達(dá)顯著高于正常對照組,且CCAT2的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的分化程度呈負(fù)相關(guān),病理診斷為低分化的腺癌患者血清CCAT2的表達(dá)量顯著高于中分化的腺癌患者,這些結(jié)果提示血清CCAT2可能成為胃

圖5 CA19-9、CEA和CA72-4診斷胃癌的ROC曲線Fig 5 The ROC curve of CA19-9,CEA and CA72-4 in the diagnosis of gastric cancer

癌臨床診斷和預(yù)后的1個(gè)新的檢測指標(biāo)。目前臨床常用的胃腸道腫瘤標(biāo)志物主要有CEA、CA19-9和CA72-4,Liang等[14]通過對2 288例胃癌患者和1 869例健康對照組的分析顯示,CEA、CA19-9和CA72-4獨(dú)立診斷胃癌的敏感度僅為20.1%～27.6%,而三者聯(lián)合診斷時(shí)可將敏感度提高至48.2%。Yu等[15]對216例胃癌患者的CEA、CA19-9和CA7-24的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,三者獨(dú)立診斷的敏感度分別為22.69%、18.98%和22.69%,而聯(lián)合診斷的敏感度提高至44.91%,這些統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,上述3種腫瘤標(biāo)志物診斷胃癌的敏感度都不高。Guo等[16]對1566例胃癌患者CEA、CA19-9和CA72-4的檢測結(jié)果進(jìn)行了ROC曲線分析,結(jié)果顯示三者的AUC分別為0.582、0.571和0.544。而本研究中CEA、CA19-9和CA72-4診斷胃癌的AUC分別為0.604、0.624和0.727,略高于文獻(xiàn)報(bào)道,但與本研究中CCAT2診斷胃癌的曲線下面積0.619相近。作為胃癌的診斷標(biāo)志物,本研究中CEA、CA19-9和CA72-4的診斷特異度高達(dá)84.47%～100%,但敏感度差,僅為10.81%～21.21%,作為診斷標(biāo)志物會(huì)導(dǎo)致漏診率很高,因此不適宜胃癌的大規(guī)模篩查和隨訪。而同樣的血清樣本,CCAT2診斷胃癌的敏感度達(dá)到78.63%,顯著高于上述3種腫瘤標(biāo)志物,故對胃癌的臨床診斷具有一定的意義。但是本研究結(jié)果顯示CCAT2診斷胃癌的特異度不高,僅為53.00%,因此作為獨(dú)立診斷的標(biāo)志物效果并不很理想,如果能夠與其他診斷標(biāo)志物如CA72-4等聯(lián)合診斷,可能會(huì)取得更好的診斷效果。

本研究對非編碼RNA CCAT2在胃癌血清中的表達(dá)進(jìn)行了檢測,并對其診斷效能進(jìn)行了評估,為非編碼RNA進(jìn)入臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。盡管非編碼RNA作為非侵入性生物標(biāo)志物存在著諸多優(yōu)點(diǎn),但由于其作用機(jī)制尚未闡明,因此血清CCAT2在胃癌臨床診斷方面的價(jià)值和意義尚需更深入的研究和大規(guī)模的臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證。