棉花陸海雜種標記偏分離染色體上重要農(nóng)藝性狀的QTL定位

戴寶生，郭歡樂，尤春源，張獻龍，林忠旭 *

（1.華中農(nóng)業(yè)大學植物科學與技術(shù)學院/作物遺傳改良國家重點實驗室，武漢430070；2.黃岡市農(nóng)業(yè)科學院，湖北黃岡438000；3.石河子農(nóng)業(yè)科技開發(fā)研究中心棉花研究所，新疆石河子832000）

棉屬栽培種包括2個重要的異源四倍體種，分別是陸地棉（Upland cotton）和海島棉（Sea island cotton）。陸地棉具有高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、適應性廣等特點，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，其產(chǎn)量占世界棉花總產(chǎn)量的90%以上，在棉花生產(chǎn)中具有十分重要的地位[1-3]。海島棉具有纖維品質(zhì)優(yōu)良等優(yōu)點，是高檔紡織品和特種棉紡織品的重要原料，在國際市場上占有一定的份額，在中國、美國、埃及和烏茲別克斯坦等植棉國仍有一定的種植面積[3]。

近年來，棉花育種進展緩慢，產(chǎn)量水平提升不明顯，早熟性難以滿足生產(chǎn)需要，棉花育種進入平臺期，傳統(tǒng)的常規(guī)育種已經(jīng)難以適應現(xiàn)代棉花育種的要求。分子標記技術(shù)的發(fā)展及覆蓋全基因組的飽和遺傳圖譜的構(gòu)建，使得研究人員能夠在分子水平對產(chǎn)量和熟性等復雜的數(shù)量性狀進行遺傳解析，能夠定位與棉花熟性、產(chǎn)量相關性狀的數(shù)量性狀位點（Quantitative trait locus，QTL）[4-8]。用海島棉和陸地棉構(gòu)建的群體遺傳多態(tài)性好，利用海陸種間群體定位棉花重要農(nóng)藝性狀QTL一直是研究熱點[9-11]。但是目前定位的QTL多是使用來自于2個親本的單一群體，沒有在多個群體中進行驗證[9-11]。

本研究使用海島棉3-79和陸地棉鄂棉22構(gòu)建了4個BC1F2群體。在田間考查各個群體的產(chǎn)量性狀和熟性相關性狀，室內(nèi)檢測各株行的纖維品質(zhì)性狀。本實驗室在構(gòu)建棉花種間連鎖圖過程中，發(fā)現(xiàn)海陸種間群體中第2、16和18號3條染色體上偏分離標記數(shù)目較多（50%以上），并且大多數(shù)標記偏向雜合型，并且偏分離標記聚集形成偏分離區(qū)域[3]。利用上述4個BC1F2群體的偏分離嚴重的3條染色體的基因型數(shù)據(jù)進行產(chǎn)量、熟性和纖維品質(zhì)相關性狀的QTL定位，挖掘這2個材料基因組上的有利等位變異，以期檢測到穩(wěn)定的QTL位點，用于QTL精細定位、基因克隆和分子標記輔助選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和田間種植

利用海島棉3-79和陸地棉品種鄂棉22（Emian 22）為親本及其正反交F1構(gòu)建了4個陸地棉基因組成分比例較大的BC1F1回交群體：Emian 22/ （Emian 22/3-79）、Emian 22/（3-79/Emian 22）、 （Emian 22/3-79）/Emian 22、 （3-79/Emian 22）/Emian22，分別簡寫為 E （E3）、E（3E）、（E3）E、（3E）E。2013 年收獲 BC1F1單株種子，2014 年在長江大學試驗地（湖北省荊州市荊州區(qū)）種植BC1F2家系和親本材料，其中E （E3）118行、E（3E）94 行、（E3）E 102 行、（3E）E 103 行。株行材料和親本按照單行小區(qū)種植，長5 m，寬0.8 m，種植10株，采用隨機區(qū)組排列，每個家系種植2個重復。

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查

調(diào)查記載各株行的出苗期、開花期、吐絮期，計算出苗至開花期（Days from seedling to flowering，SF）、吐絮期（Date of boll opening，DBO）、開花至吐絮期（Days from flowering to boll opening，F(xiàn)BO）等熟性相關性狀。在棉花吐絮期，收獲棉株中部吐絮良好的棉鈴20個，室內(nèi)測定鈴重（Boll weight，BW）、衣分（Lint percent，LP）、籽指（Seed index，SI）、衣指（Lint index，LI）等產(chǎn)量相關性狀?？疾炖w維長度 （Fiber length，F(xiàn)L）、斷裂比強度（Fiber strength，F(xiàn)S）、馬克隆值（Micronaire value，MIC）、纖維長度整齊度指數(shù) （Fiber length uniform，F(xiàn)LU）、纖維成熟度（Fiber maturity，F(xiàn)M）、紡紗均勻性指數(shù) （Spinning consistency index，SCI）及短纖維率 （Short fiber ratio，SFR）7個纖維品質(zhì)性狀。

1.3 數(shù)據(jù)分析

4個BC1F2群體的熟性相關性狀、產(chǎn)量性狀和纖維品質(zhì)性狀使用統(tǒng)計學軟件R包library（pastecs）的 stat.desc函數(shù)[12]進行描述性統(tǒng)計分析，包括每個性狀的最大值、最小值、平均值、標準差、變異系數(shù)、偏度系數(shù)、峰度系數(shù)和正態(tài)性檢驗結(jié)果等。親本間的性狀差異通過t測驗檢驗。性狀間的相關分析采用統(tǒng)計學軟件R包library（psych）中的corr.test函數(shù)[13]進行。選取本實驗室發(fā)表的棉花海陸種間圖譜上第2、16和18號染色體上的共顯性標記對全部群體進行了基因型分析?；?個群體的表型數(shù)據(jù)，對各個群體的熟性相關性狀、產(chǎn)量性狀和纖維品質(zhì)相關性狀進行QTL檢測。采用軟件Windows QTL Cartographer 2.5[14]中的復合區(qū)間作圖法（Composite interval mapping，CIM）進行QTL區(qū)間定位和效應估計，進行1 000次置換檢驗，對數(shù)優(yōu)勢比（Logarithm of the odd score，LOD）大于 2.5 時認為存在QTL。QTL命名按照Mc Couch等[15]的規(guī)則進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及BC1F2群體的產(chǎn)量、纖維品質(zhì)和熟性相關性狀的表現(xiàn)

表1為4個群體及親本的種植表現(xiàn)，對產(chǎn)量、纖維品質(zhì)和熟性相關性狀進行了統(tǒng)計分析。從表1可知，2個親本的斷裂比強度、紡紗均勻性指數(shù)、鈴重、衣分和出苗期至開花期歷時5個性狀存在極顯著差異，纖維長度和短纖維率2個性狀存在顯著差異，而其他7個性狀差異不顯著。正反交F1表型分析結(jié)果表明，正反交F1的產(chǎn)量相關性狀和熟性相關性狀差異不顯著，這說明鄂棉22和3-79雜交F1產(chǎn)量性狀和熟性相關性狀受核基因組控制，與細胞質(zhì)基因組無關；但斷裂比強度存在顯著差異，采用海島棉3-79做母本的F1纖維斷裂比強度較好。

由表2和表3可知，短纖維率在4個BC1F2群體中變異較大，變異系數(shù)為18.0%～23.0%；纖維成熟度在4個群體中變異較小，變異系數(shù)為1.0%～2.0%。與親本相比，4個群體每個性狀的最大值都超過了高值親本，具有正向超親優(yōu)勢，同時最低值都比低值親本還低，表明這些性狀同時具有正向和負向超親優(yōu)勢，顯示了超親分離現(xiàn)象。

表2 4個BC1F2群體的纖維品質(zhì)相關性狀表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計描述Table 2 Descriptive statistics of fiber quality-related traits in the four BC1F2populations

表3 4個BC1F2群體的產(chǎn)量和熟性相關性狀表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計描述Table 3 Descriptive statistics of yield-and matarity traits in the four BC1F2populations

Shapiro-Wilk正態(tài)分布檢驗顯示，就纖維品質(zhì)相關性狀而言，短纖維率在4個群體中均不符合正態(tài)分布，馬克隆值在E（E3）群體不符合正態(tài)分布，其他6個纖維品質(zhì)性狀在4個群體中均符合正態(tài)分布。但是與棉花熟性相關的3個性狀在4個群體中都不符合正態(tài)分布，說明熟性相關性狀可能與環(huán)境有更強的互作效應。在產(chǎn)量性狀中，鈴重在4個群體中均符合正態(tài)分布；衣分在除E（E3）外的其他3個群體中均符合正態(tài)分布；籽指僅在（3E）E群體中符合正態(tài)分布；衣指在除E（3E）外的其他3個群體中均符合正態(tài)分布。峰度和偏度分析表明，除衣分在E（E3），衣指在E（E3）、E（3E），SF 在 E（3E）、（E3）E、（3E）E，F(xiàn)BO在（E3）E、（3E）E 外，其他性狀在各群體中偏度和峰度的絕對值都小于1，說明這些性狀近似于正態(tài)分布，表明這些性狀是受多基因控制的數(shù)量性狀。

2.2 棉花熟性、產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀的相關分析

棉花熟性、產(chǎn)量與纖維品質(zhì)的相關性分析結(jié)果（表4）表明：纖維長度與多數(shù)品質(zhì)相關性狀極顯著相關，其中極顯著正相關的有纖維斷裂比強度、長度整齊度指數(shù)、紡紗均勻性指數(shù)，極顯著負相關的有馬克隆值、短纖維率。纖維長度與籽指呈顯著正相關，與衣分呈極顯著負相關。纖維斷裂比強度與紡紗均勻性指數(shù)呈極顯著正相關，與短纖維率呈極顯著負相關。馬克隆值與纖維成熟度呈極顯著正相關，與紡紗均勻性指數(shù)呈極顯著負相關。纖維長度整齊度指數(shù)與紡紗均勻性指數(shù)呈極顯著正相關，與短纖維率呈極顯著負相關。紡紗均勻性指數(shù)與短纖維率呈極顯著負相關。短纖維率與籽指呈極顯著負相關。衣分與衣指呈極顯著正相關，與籽指呈顯著負相關。出苗至開花期與吐絮期、開花至吐絮期呈極顯著正相關。吐絮期與開花至吐絮期呈極顯著正相關。

2.3 棉花熟性、產(chǎn)量和纖維品質(zhì)性狀的QTL定位

利用復合區(qū)間作圖法對4個BC1F2分離群體的纖維品質(zhì)、產(chǎn)量及熟性相關性狀進行QTL定位分析，檢測到 47個 QTLs（表 5、表 6和圖 1），在 E（E3）、E（3E）、（E3）E 和（3E）E 中分別檢測到12、7、15和 13個 QTLs， 解釋 8.8%～30.9%的表型變異，LOD值為2.535～7.468。在這47個QTL中，27個與纖維品質(zhì)性狀相關，7個與產(chǎn)量性狀相關，13個與熟性相關。

表4 4個群體性狀間相關分析Table 4 Correlation analysis between traits in the four BC1F2populations

2.3.1纖維品質(zhì)性狀的QTL定位。利用4個BC1F2分離群體數(shù)據(jù)通過CIM法共定位到27個纖維品質(zhì)相關性狀QTLs（表5）。檢測到5個與纖維長度相關的QTLs，1個位于2號染色體，1個位于16號染色體，3個位于18號染色體。單一QTL解釋 10.8%～19.7%表型變異，LOD值為2.535～3.558。其中qFL-c2-1和qFL-c18-1的加性效應均為負值，分別為－2.208和－2.170，其他3個QTL的加性效應為正值。有4個與斷裂比強度有關的QTLs，2個位于16號染色體，2個QTL位于18號染色體。單一QTL解釋13.3%～30.9%表型變異，LOD值為3.322～7.468。qFS-c16-2和qFS-c18-2的加性效應為負值，而qFS-c16-1和qFS-c18-1的加性效應為正值。檢測到2個與馬克隆值有關的QTLs，分別位于2號和18號染色體。單一QTL解釋14.2%～14.6%表型變異，LOD值為3.079～3.327。qMIC-c2和qMIC-c18的加性效應為負值，分別為－0.341和－0.397。有4個與纖維長度整齊度指數(shù)有關的QTLs，2、16號染色體各1個，18號染色體上2個。單一QTL解釋10.7%～27.9%表型變異，LOD值為 2.985～4.350。其中qFLU-c16的加性效應為負值，其他3個QTLs的加性效應為正值。有3個與纖維成熟度有關的QTLs，均位于18號染色體。單一QTL解釋14.0%～19.0%表型變異，LOD值為2.699～4.109。其中qFM-c18-1的加性效應為負值，其他2個QTLs的加性效應為正值。有4個與紡紗均勻性指數(shù)有關的QTLs，1個位于2號染色體，2個位于16號染色體，1個QTL位于18號染色體。單一QTL解釋9.0%～24.4%表型變異，LOD值為 2.532～4.831。其中qSCI-c16-2、qSCI-c18-1的加性效應均為負值，其他2個QTL的加性效應為正值。檢測到5個與短纖維率有關的QTLs，2個位于16號染色體，3個位于18號染色體。單一QTL解釋 11.4%～18.1%表型變異，LOD值為2.705～3.779。其中qSFR-c18-1和qSFR-c18-3的加性效應均為負值，分別是－1.899和－1.946，其他3個QTLs的加性效應為正值。

表5 4個群體中纖維品質(zhì)相關性狀的QTL定位Table 5 QTL for fiber quality related traits in the four BC1F2populations

表6 4個群體產(chǎn)量及熟性相關性狀QTL定位Table 6 QTL for yield and earliness traits in the four BC1F2populations

圖1 4個群體棉花重要農(nóng)藝性狀在2號、16號和18號染色體上的QTL定位Fig.1 QTL mapping on chromosome 2（A）,16（B）and 18（C）for cotton important traits in the four BC1F2populations

2.3.2產(chǎn)量性狀的QTL定位。利用4個BC1F2分離群體產(chǎn)量性狀數(shù)據(jù)，通過CIM法共定位7個與棉花產(chǎn)量相關性狀QTLs（表6）。檢測到3個與鈴重相關的QTLs，1個位于2號染色體，2個位于18號染色體；單一QTL解釋10.9%～13.9%表型變異，LOD 值為 3.256～3.575。qBW-c2、qBW-c18-1和qBW-c18-2的加性效應均為正值，分別是0.374、0.422和0.372。檢測到2個與衣分相關的QTLs，均位于2號染色體。單一QTL解釋8.8%～11.5%表型變異，LOD值為 2.659～2.710。qLP-c2-1和qLP-c2-2的加性效應均為正值，分別是2.217和2.105，有利等位基因和增效作用均來源于鄂棉22。2個與衣指有關的QTLs均位于16號染色體。單一QTL解釋13.5%～17.4%表型變異 ，LOD 值 為 2.773～3.003。qLI-c16-1 和qLI-c16-2的加性效應均為負值，分別是－0.602和－0.691。

2.3.3熟性相關性狀的QTL定位。利用4個BClF2分離群體熟性數(shù)據(jù)，通過CIM法共定位13個與棉花熟性相關性狀QTLs（表6）。檢測到5個與出苗至開花期有關的QTLs，4個位于16號染色體，1個位于18號染色體。單一QTL解釋9.4%～19.4%表型變異，LOD值為2.557～5.037。qSF-c16-2、qSF-c16-4和qSF-c18-1的加性效應均為負值，分別為－2.933、－3.775、和－3.639，有利等位基因和增效作用均來源于鄂棉22；qSF-c16-1和qSF-c16-3的加性效應為正值，分別為3.987和4.893，有利等位基因和增效作用均來源于3-79。檢測到4個與出苗至吐絮期有關的QTLs，16、18號染色體上各2個。單一QTL解釋11.0%～19.3%表型變異，LOD值為 2.824～4.429。qDBO-c16-1、qDBO-c16-2 和qDBO-c18-2的加性效應均為正值，分別為8.776、9.646和7.494，增效作用均來源于3-79。而qDBO-c18-1的加性效應為負值，為－5.591，有利等位基因和增效作用均來源于鄂棉22。檢測到4個與開花至吐絮期相關的QTLs，1個位于16號染色體，3個位于18號染色體。單一QTL解釋11.7%～16.4%表型變異，LOD值為 3.193～3.683。qFBO-c16、qFBO-c18-1和qFBO-c18-2的加性效應均為正值，分別為 4.966、6.605和4.806，增效作用均來源于3-79。qFBO-c18-3的加性效應為負值（－6.499），有利等位基因和增效作用均來源于鄂棉22。

3 討論

3.1 作圖群體選擇

隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，定位重要性狀的QTL在多種作物中進展快速。海島棉和陸地棉都是世界范圍重要的棉花栽培種，其中陸地棉貢獻了90%以上的棉花產(chǎn)量，而海島棉品質(zhì)優(yōu)良，在高檔紡織品工業(yè)中有重要的應用。海島棉和陸地棉遺傳差異較大，分子標記多態(tài)性好，因此海陸種間群體廣泛用于定位棉花重要性狀相關QTL。

早在1998年Jiang等[16]利用陸地棉CAMD-E和海島棉Sea Island Seaberry雜交產(chǎn)生的F2群體（含有271個單株），構(gòu)建了1張含有261個限制性片段長度多態(tài)性 （Restriction fragment length polymorphism，RFLP）標記、27個連鎖群的連鎖圖，這個連鎖圖全長為3 767 cM，標記間距為14.4 cM，還有16個標記沒有被定位到連鎖圖上。對纖維長度、纖維強度等多個纖維品質(zhì)性狀進行QTL定位，共檢測到14個相關的QTL。研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)QTL定位在D基因組上，認為在棉花馴化和遺傳改良過程中D基因組可能對纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的改良起到了巨大的作用。

隨后棉花科研工作者利用不同的親本構(gòu)建各種群體進行棉花QTL定位，包括BCnFn、回交重組自交系（Backcross inbred lines，BIL）等[17-22]。Chee等[23-24]利用陸地棉Tamcot 2111和海島棉Pima S6培育了高代回交群體，對24個BC3F1單株基因型分析結(jié)果表明，平均來說每個單株基因組中海島棉等位位點約占總位點的7.3%，24個單株覆蓋了海島棉基因組的70%。由24個單株產(chǎn)生了24個BC3F2家系。利用這些家系進行了纖維品質(zhì)性狀的QTL定位，分別檢測到22、8、6和2個與纖維長度、長度整齊度指數(shù)、短纖維率、斷裂伸長率相關的QTLs。

本研究利用2個親本鄂棉22和3-79構(gòu)建了4個BC1群體。海島棉3-79基因組已被測序[3]，根據(jù)定位的QTL區(qū)間，很容易得到相應的基因組序列信息，因此利用3-79作為親本能夠加速相關QTL的定位和克隆。

根據(jù)交配方式可將這4個群體分為雄性分離群體和雌性分離群體，這種交配設計有助于檢測母體效應和花粉或者胚囊產(chǎn)生的細胞質(zhì)對QTL表達的影響。在本研究中僅qFLU-c18同時在 2個群體（3E）E和 E（3E）中被檢測到，這個QTL臨近的標記均為NAU3232，可能是3-79細胞質(zhì)基因?qū)Ψ蛛x配子產(chǎn)生了一定的影響所致。qFL-c18-2 和qFL-c18-3 分別在 （3E）E 和（E3）E中被檢測到，這2個QTLs均分布于18號染色體且相距較近，可能是同1個位點，這2個QTLs僅在雌性分離群體中被檢測到，說明它們在母體環(huán)境中得到了有效的表達。其他的纖維品質(zhì)QTLs均僅在1個群體中被檢測到。

3.2 群體間QTL比較分析

為剖析棉花產(chǎn)量、熟性和纖維品質(zhì)等復雜數(shù)量性狀的遺傳基礎，很多研究者進行了QTL定位研究。由于棉花熟性、產(chǎn)量和纖維品質(zhì)等性狀都是數(shù)量性狀，受環(huán)境影響大，所以不同的作圖親本、群體類型和單株數(shù)量、標記類型和QTL定位方法等[25-33]會導致研究結(jié)果不一致，不同研究相互之間不能交叉驗證。即使采用相同的親本，也可能由于不同世代、不同群體類型導致QTL定位結(jié)果不一樣，也可能存在QTL不能同時被檢測到及QTL效應大小不一樣的問題[34]。

為克服這些問題，比較圖譜和元分析等綜合分析方法被用來整合分析不同研究中檢測到的QTL，為后續(xù)的QTLs圖位克隆和分子輔助選擇（Molecular marker-assisted selection，MAS） 提供有用的參考信息[34-37]。Said等[34,38-39]搜集了59篇文獻中的1 075個陸地棉種內(nèi)QTLs和30篇文獻中1 059個海陸種間QTLs進行了綜合的比較元QTL 分析（Comprehensive comparative meta QTL analysis）。表7分析了本研究定位的QTLs與Said等[38-39]綜合分析QTL的染色體分布，結(jié)果表明在本研究中檢測到的大部分QTLs在綜合分析中也被檢測到。如位于2號染色體的BW、FL、FLU、LP、MIC 等性狀的 QTLs， 位于 16號的 FL、FS、FLU等性狀的QTLs，位于18號染色體的BW、DBO、FL、FS、FLU、MIC 等性狀相關的 QTLs。本研究也鑒定出了一些在綜合圖譜上沒有報道的QTLs，如 16號染色體的qDBO-c16-1、qDBO-c16-2 和qLI-c16-1、qLI-c16-2，18號染色體的qSF-c18-1。這些新鑒定的QTLs可能為QTL比較分析提供新的參考信息。

表7 QTL比較結(jié)果Table 7 QTL comparison between our study and Meta QTL

4 結(jié)論

本研究在陸海種間群體中利用復合區(qū)間作圖方法對4個BC1F2分離群體的產(chǎn)量、熟性相關及纖維相關性狀進行QTL定位，共檢測到47個QTLs，其中檢測到27個纖維性狀相關QTLs，單個QTL解釋9.0%～30.9%的表型變異；檢測到7個產(chǎn)量相關性狀QTLs，單個QTL解釋8.8%～17.4%的表型變異；檢測到13個熟性相關QTLs，單個QTL解釋9.4%～19.4%的表型變異。本研究鑒定出一些新的QTL，如16號染色體的qDBO-c16-1、qDBO-c16-2 和qLI-c16-1、qLI-c16-2，18號染色體的qSF-c18-1。