研究生等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)探討

張玉蘋　裘令瑛　陶艷春

摘要：針對(duì)等溫滴定量熱技術(shù)是研究分子間相互作用的重要手段，在等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)課中，教師針對(duì)本單位的研究體系，從學(xué)生的角度出發(fā)，采用多種教學(xué)方式，重點(diǎn)向?qū)W生介紹儀器的注意事項(xiàng)、操作步驟、數(shù)據(jù)分析三方面內(nèi)容，使儀器的價(jià)值得到充分發(fā)揮，更好地為科研工作者提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：等溫滴定量熱；熱力學(xué)；分子間作用；教學(xué)討論

中圖分類號(hào)：G643 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2018）49-0261-02

等溫滴定量熱法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是近年來發(fā)展起來的研究分子間相互作用的重要方法，其中包括蛋白和蛋白，蛋白和核酸，蛋白和小分子，蛋白和金屬離子，靶分子和藥物分子，酶和抑制劑，抗體和抗原等之間的相互作用[1-6]。ITC通過測(cè)定分子價(jià)鍵的打開和形成過程中吸收和釋放的熱量來獲取分子間相互作用的定性和定量信息，如：結(jié)合常數(shù)（KD）、反應(yīng)化學(xué)計(jì)量（n）、反應(yīng)焓變（ΔH）和反應(yīng)熵變（ΔS）等。由于此方法具有較高靈敏度、較好重現(xiàn)性、測(cè)試直接、無需標(biāo)記等特點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究和藥物研發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域[7，8]。目前，許多高校、研究所、藥企也都將ITC作為研究分子間相互作用、確認(rèn)藥-靶結(jié)合和改造藥物的黃金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。隨著國家對(duì)科學(xué)研究的資金投入，高校和研究所對(duì)貴重科研儀器的購買增多，如何高效使用等溫滴定量熱儀更好地服務(wù)于科研工作者，是科研單位需要認(rèn)真思考的問題。下面結(jié)合實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，以ITC200型超微量等溫滴定量熱儀為例，從儀器的注意事項(xiàng)、操作步驟、數(shù)據(jù)分析三方面，談?wù)勅绾螌?duì)學(xué)生進(jìn)行規(guī)范的等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

一、儀器的使用注意事項(xiàng)

將等溫滴定量熱儀對(duì)研究生開放使用，一方面能提高儀器的利用率，充分發(fā)揮儀器的使用價(jià)值；另一方面能促進(jìn)學(xué)生與儀器親密接觸，及時(shí)獲取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為開展高水平的科學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。由于等溫滴定量熱儀屬于高端精密儀器，其原理及操作較為復(fù)雜，一旦操作使用不當(dāng)，易造成儀器損壞，后果不堪設(shè)想，所以，有必要對(duì)每一位測(cè)試學(xué)生進(jìn)行詳細(xì)的儀器理論講解與嚴(yán)格的上機(jī)操作培訓(xùn)。

首先，要讓上機(jī)操作的學(xué)生掌握儀器的原理、結(jié)構(gòu)組成，熟悉測(cè)試流程及詳細(xì)的操作步驟，掌握數(shù)據(jù)的處理分析等。例如，ITC200型超微量等溫滴定量熱儀的組成部件主要包括塔臺(tái)、注射針、反應(yīng)滴定針、樣品反應(yīng)池、清洗樣品反應(yīng)池的小型機(jī)械泵、高速旋轉(zhuǎn)的攪拌器、檢測(cè)器、控制器、清洗用的溶液甁以及用于連接控制器的電腦等。其中，用于測(cè)試的反應(yīng)滴定針由石英玻璃制成，易破碎，使用前應(yīng)仔細(xì)檢測(cè)是否破裂，測(cè)試過程中，謹(jǐn)記輕拿輕放，將金屬接頭插入固定支架上的鏈接孔時(shí)，輕輕擰緊即可，切勿用力擰死。比如，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)確認(rèn)樣品池、參比池、注射器等部件的干凈，一定要依次用甲醇、蒸餾水、緩沖液對(duì)它們進(jìn)行清洗，在水滴水實(shí)驗(yàn)的噪音水平達(dá)到測(cè)試要求后才可以開始測(cè)試樣品。

其次，介紹正常儀器操作中可能出現(xiàn)的異常情況，這些情況的出現(xiàn)不僅會(huì)影響儀器的狀態(tài)，還會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及后面的學(xué)生的實(shí)驗(yàn)造成影響。比如儀器設(shè)備要求環(huán)境潔凈且無震動(dòng)，測(cè)試時(shí)人為帶來的強(qiáng)光、氣流波動(dòng)、儀器震動(dòng)等，都將會(huì)影響測(cè)量結(jié)果，產(chǎn)生測(cè)試誤差。再如，嚴(yán)禁學(xué)生私自使用U盤拷貝數(shù)據(jù)，一旦有病毒帶入將會(huì)導(dǎo)致主機(jī)癱瘓，造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)丟失甚至重裝儀器控制軟件的風(fēng)險(xiǎn)，這將會(huì)影響學(xué)生的數(shù)據(jù)采集和科研成果的發(fā)表，所以我們要求學(xué)生用光盤刻錄存儲(chǔ)數(shù)據(jù)已保證儀器的正常使用。以上事例要反復(fù)強(qiáng)調(diào)，否則會(huì)對(duì)學(xué)生、老師及實(shí)驗(yàn)室造成極大的影響。

二、測(cè)試操作步驟

為了讓學(xué)生更加明白儀器的組成與原理、測(cè)試流程、操作方法、注意事項(xiàng)等，教師應(yīng)采用理論與實(shí)踐相結(jié)合的方式，通過測(cè)試某一樣品為例詳細(xì)講解，提高教學(xué)效果。下面以美國通用電氣公司生產(chǎn)的ITC200型超微量等溫滴定量熱儀為事例展開討論，具體測(cè)試操作步驟如下。①采用水滴水實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)儀器樣品池是否干凈。②選擇合適的緩沖液，準(zhǔn)備待測(cè)樣品。③根據(jù)待測(cè)樣品特性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，由儀器軟件給出預(yù)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，以及推薦使用的樣品濃度。④樣品池加樣、參比池加超純水、滴定注射器加樣。⑤設(shè)置實(shí)驗(yàn)參數(shù)（如總注射次數(shù)、樣品池溫度、滴定時(shí)間間隔、攪拌器轉(zhuǎn)速、單次滴定體積、兩次滴定的時(shí)間間隔、數(shù)據(jù)輸出頻率）。⑥測(cè)試結(jié)束后，保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)文件和實(shí)驗(yàn)參數(shù)文件，并重復(fù)步驟1做好儀器的清潔。

實(shí)驗(yàn)的成功主要取決于兩點(diǎn)：一是儀器的干凈程度，二是待測(cè)樣品的配制。教師應(yīng)詳細(xì)介紹如何確認(rèn)樣品池是否干凈。比如，先向樣品池、參比池、滴定注射器加入超純水，接著采用水滴水的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)是否干凈，只有噪音水平達(dá)到測(cè)試要求才可以開始測(cè)試樣品。若樣品池太臟可采用去垢劑、高溫泡洗。準(zhǔn)備待測(cè)樣品時(shí)，教師需重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)滴定物與被滴定物間的緩沖液、pH、鹽濃度、DMSO濃度等保持完全一致，并且要在同一緩沖液中透析或者置換大分子和配體。雖然DMSO對(duì)小分子有助溶效果，但也要控制量，最好不要超過5%，不然會(huì)破壞蛋白，對(duì)于水溶性太差的樣品，可借助超聲、加溫、調(diào)pH等方法。在確定樣品濃度后，依次對(duì)樣品池、參比池、滴定注射器加樣。此部分內(nèi)容不僅要詳細(xì)介紹，還要有教師與學(xué)生的互動(dòng)，通過理論與實(shí)際動(dòng)手操作，讓學(xué)生掌握加樣的流程與細(xì)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在Setup模式下分別點(diǎn)擊Data File Path與Setup File Path中的文件夾名稱，保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)文件和實(shí)驗(yàn)參數(shù)文件。然后取出樣品池中的樣品，做好樣品池和滴定注射器的清洗。

三、數(shù)據(jù)處理分析

等溫滴定量熱法直接測(cè)量的是生物化學(xué)結(jié)合過程中釋放或吸收的熱量，通過計(jì)算給出結(jié)合常數(shù)（KD）、反應(yīng)化學(xué)計(jì)量（n）、焓（ΔH）和熵（ΔS）。因此，可以結(jié)合實(shí)例介紹數(shù)據(jù)分析的步驟，讓學(xué)生掌握數(shù)據(jù)處理分析的方法，尤其是如何扣除背景部分。具體的數(shù)據(jù)分析步驟如下：①將ITC實(shí)驗(yàn)結(jié)果文件導(dǎo)入Origin軟件；②對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行積分，并刪除錯(cuò)誤的點(diǎn)數(shù)據(jù)；③利用點(diǎn)對(duì)點(diǎn)或最后幾個(gè)點(diǎn)扣除背景，并運(yùn)用合適的結(jié)合模型擬合數(shù)據(jù)；④觀察擬合效果，利用軟件計(jì)算得出結(jié)合常數(shù)（KD）、反應(yīng)化學(xué)計(jì)量（n）、焓（ΔH）和熵（ΔS）。在講解此部分內(nèi)容時(shí)，如何扣除背景應(yīng)重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)。如點(diǎn)對(duì)點(diǎn)扣除背景時(shí)，“Cell Vol”樣品池體積的數(shù)值是不能更改的。再如用最后幾個(gè)點(diǎn)扣除背景時(shí)，需先觀察NDH的最后4—5滴的結(jié)果，與參照實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似且數(shù)值穩(wěn)定后，方可進(jìn)行后續(xù)處理。在選擇模型擬合數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)將技巧介紹給學(xué)生，如反復(fù)多次點(diǎn)擊直至Chi-Sqr值不再減小為止，以此提高擬合效果。對(duì)于擬合效果不好時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)講解如何處理，比如調(diào)整滴定物或者被滴定物的濃度，重新實(shí)驗(yàn)以達(dá)到好的擬合效果。

四、結(jié)束語

等溫滴定量熱技術(shù)是研究分子之間相互作用的重要手段，高速地推動(dòng)著生物動(dòng)力學(xué)與熱力學(xué)的蓬勃發(fā)展，尤其是在研究藥物—蛋白、蛋白—蛋白、酶催化等方面。作為實(shí)驗(yàn)課教師應(yīng)該針對(duì)科研單位的研究體系，從學(xué)生的角度出發(fā)，采用多種教學(xué)方式，安排實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，使等溫滴定量熱儀的價(jià)值得到充分發(fā)揮，并更好地為科研工作者提供有力的數(shù)據(jù)支持。

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