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    富含蛋氨酸醇溶蛋白在產(chǎn)朊假絲酵母中的表達研究

    2018-12-10 06:35:18其布日薩初拉蘇少鋒王蘊華劉紅葵吳青海
    畜牧與飼料科學(xué) 2018年11期
    關(guān)鍵詞:蛋氨酸酵母菌酵母

    其布日,薩初拉,蘇少鋒,高 娃,王蘊華,劉紅葵,吳青海,呼 和

    (內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

    在絕大多數(shù)日糧情況下,蛋氨酸和賴氨酸是奶牛泌乳和乳蛋白合成的主要限制性氨基酸,在以玉米青貯為基礎(chǔ)的日糧中,蛋氨酸是乳汁和乳蛋白合成的第一限制性氨基酸[1-2]。國內(nèi)外研究表明,奶牛補充過瘤胃保護蛋氨酸能增加產(chǎn)奶量[3-9],提高乳中乳蛋白[10-11]、乳脂肪[8,11]及總固形物含量[12]。此外,蛋氨酸作為反芻動物的重要限制性氨基酸,在充分發(fā)揮動物生產(chǎn)潛能,降低糞、尿氮排放等方面起著巨大作用[13]。

    產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis,C.utilis)是國家衛(wèi)生健康委員會規(guī)定的可用于保健食品的11種真菌菌種之一,其既有酵母菌的優(yōu)良特性,又可應(yīng)用于食品加工行業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中。酵母菌制劑的應(yīng)用不僅可以節(jié)約生產(chǎn)成本,減少疾病發(fā)生,而且可以提高經(jīng)濟效益,有利于獲得高品質(zhì)的食品、畜牧產(chǎn)品以及口服藥品等[14]。隨著對產(chǎn)朊假絲酵母研究的深入,產(chǎn)朊假絲酵母表達系統(tǒng)也不斷成熟。在抗性標(biāo)記的選擇方面,產(chǎn)朊假絲酵母基因組中存在一段L41基因,該基因?qū)俜啪€菌酮(cycloheximide,CYH)敏感性基因。研究表明,對L41基因第56位氨基酸密碼子的一個堿基進行突變即可獲得CYH抗性基因,這為構(gòu)建產(chǎn)朊假絲酵母整合型表達載體提供了便利[15]。GAP-p(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)是一種組成型強啟動子,已從產(chǎn)朊假絲酵母中成功克?。?6]。產(chǎn)朊假絲酵母沒有穩(wěn)定的附加質(zhì)粒,因此,采用整合型載體將外源基因整合到染色體中是產(chǎn)朊假絲酵母引入外源基因的主要方式。使用重復(fù)序列(rDNA)作為整合載體同源位點是提高外源基因在酵母基因組中拷貝數(shù)的有效途徑[17-18]。有學(xué)者研究表明,產(chǎn)朊假絲酵母是表達異源蛋白的有效宿主[19-20]。

    圖1 重組質(zhì)粒pBR322-GAP-zein(PGZ)構(gòu)建技術(shù)路線

    玉米胚乳中的玉米醇溶蛋白(zein)是天然存在的穩(wěn)定型蛋白,富含含硫氨基酸(含有20%的蛋氨酸),其中以δ-10kD型玉米醇溶蛋白的含量最高,并且該蛋白在反芻動物的瘤胃中不被降解且具有腸溶性[21],可以巧妙地達到過瘤胃保護的目的。近年來,δ-10kD型玉米醇溶蛋白基因在植物中表達的研究報道較多[22-26],但在微生物中表達的研究報道較少[27-29],尤其尚未見在產(chǎn)朊假絲酵母中表達的研究報道。該研究采用同源重組技術(shù)將zein基因表達盒整合到產(chǎn)朊假絲酵母的染色體上,構(gòu)建表達zein蛋白的產(chǎn)朊假絲酵母工程菌,為解決奶牛日糧中主要限制性氨基酸不平衡,改善奶牛蛋白飼料利用率,提高奶牛生產(chǎn)性能提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 產(chǎn)朊假絲酵母菌株:購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,編號為CICC 1769;大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans-T1購自北京全式金生物有限公司;pMD19-T克隆載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

    1.1.2 培養(yǎng)基:YPD培養(yǎng)基,配方為1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖 (固體培養(yǎng)基瓊脂含量為1.5%)。

    1.1.3 主要試劑:山梨醇,購自北京索萊寶科技有限公司;山梨醇Buffer:用0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH值=7.4)配制1.2 mol/L山梨醇溶液;0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液 (pH值=7.4)的配制:77.4 mL 0.1 mol/L Na2HPO4溶液+22.6 mL 0.1 mol/L NaH2PO4溶液;放線菌酮(CYH)購自Sigma-Aldrich公司;酵母轉(zhuǎn)化試劑盒YeastmakerTMYeast Transformation System 2購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;Lyticase、質(zhì)粒小提試劑盒、酵母基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;試驗中用到的內(nèi)切酶購自NEB(北京)有限公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 zein基因密碼子的優(yōu)化及表達盒的拼接合成:在NCBI中查找δ-10kD-醇溶蛋白基因序列、酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(GAP-p)和終止子(GAP-t)序列,由基因合成公司(蘇州金唯智生物科技有限公司)進行zein基因密碼子偏愛性及相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化后,將啟動子(GAP-p)和終止子(GAP-t)序列與優(yōu)化過的zein基因序列進行拼接合成,然后在兩端加入設(shè)計好的酶切位點,構(gòu)建表達盒(GAP-p)-zein-(GAP-t)。

    1.2.2 含有zein基因表達盒的整合載體的構(gòu)建:提取含(GAP-p)-zein-(GAP-t)表達盒的 pUC57和pBR322質(zhì)粒,分別用EcoRⅤ和BamHⅠ進行酶切,回收目的片段。用T4 DNA連接酶將片段進行連接,獲得質(zhì)粒 pBR322-GAP-zein(PGZ)(見圖1),同時加入設(shè)計好的酶切位點,然后對重組質(zhì)粒進行酶切和測序鑒定。

    表1 PCR引物信息[30]

    圖2 重組質(zhì)粒pBR322-GAP-zein-mL41(PGZM)構(gòu)建技術(shù)路線

    1.2.3 含有放線菌酮抗性基因的整合載體的構(gòu)建

    1.2.3.1 放線菌酮基因的點突變:復(fù)蘇擴增產(chǎn)朊假絲酵母后提取其基因組,進行重疊PCR試驗。以基因組為模板,以A1/B2,B1/A2為引物 (見表1)進行PCR擴增,對2組PCR產(chǎn)物進行膠回收,再以2組回收產(chǎn)物為模板進行PCR試驗,PCR產(chǎn)物膠回收后進行加A反應(yīng),將目的基因與pMD19-T 載體進行連接[30],轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,篩選陽性克隆子,重組子培養(yǎng)擴增,提取質(zhì)粒酶切鑒定后將陽性克隆子進行核苷酸序列測定 (由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)。利用生物信息學(xué)軟件將所得序列和NCBI發(fā)布的序列進行比對分析。

    1.2.3.2 含有放線菌酮抗性基因的整合載體的構(gòu)建:將目的基因載體pMD19-T-mL41質(zhì)粒和pBR322-GAP-zein(PGZ)載體酶切,回收與純化后,將目的基因mL41與載體pBR322-GAP-zein(PGZ)進行連接,構(gòu)建pBR322-GAP-zein-mL41(PGZM)載體(見圖2)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,篩選陽性克隆子,培養(yǎng)擴增,提取質(zhì)粒酶切鑒定后,將陽性克隆子進行核苷酸序列測定。利用生物信息學(xué)軟件將所得序列和NCBI發(fā)布的序列進行比對分析。

    圖3 重組質(zhì)粒pBR322-GAP-zein-mL41-18S rDNA(PGZM18)構(gòu)建技術(shù)路線

    1.2.3.3 產(chǎn)朊假絲酵母放線菌酮抗性試驗:用無水乙醇溶解放線菌酮(CYH),配制母液濃度為50 mg/mL的 CYH 溶液, 然后配制加入 5、10、15、20 μg/mL放線菌酮的YPD培養(yǎng)基,將產(chǎn)朊假絲酵母用0.9%生理鹽水稀釋104倍后進行涂布培養(yǎng),觀察菌落生長狀況。

    1.2.4 同源重組表達載體的構(gòu)建:以產(chǎn)朊假絲酵母基因組為模板,擴增克隆18S rDNA序列[26],回收與純化目的基因PCR產(chǎn)物,加A反應(yīng)后與pMD19-T載體連接。將載體pBR322-GAP-zeinmL41和目的基因載體pMD19-T-18S rDNA質(zhì)粒酶切后,進行回收與純化,對載體進行去磷酸化處理,目的基因18S rDNA與載體pBR322-GAP-zein-mL41(PGZM)進行連接,構(gòu)建 pBR322-GAP-zein-mL41-18S rDNA(PGZM18)載體(見圖 3),對載體進行酶切和測序鑒定。

    1.2.5 構(gòu)建含zein基因的產(chǎn)朊假絲酵母基因工程菌:提取大腸桿菌中的酵母表達載體質(zhì)粒PGZM18,用NcoⅠ進行單酶切,酶切產(chǎn)物膠回收,制備產(chǎn)朊假絲酵母感受態(tài)細胞,將酶切回收產(chǎn)物用LiAC試劑方法轉(zhuǎn)化到產(chǎn)朊假絲酵母中,同源整合到染色體上。將轉(zhuǎn)化子涂布到含有CYH的YPD平板上28℃培養(yǎng)3~5 d。將酵母重組子擴增培養(yǎng)后提取酵母基因組,用目的基因zein引物進行PCR鑒定和測序鑒定。

    1.2.6 液相色譜法測定產(chǎn)朊假絲酵母工程菌中的蛋氨酸含量:將未轉(zhuǎn)化目的基因的產(chǎn)朊假絲酵母與轉(zhuǎn)化目的基因的產(chǎn)朊假絲酵母分別設(shè)為對照組和試驗組,分別在YPD和含放線菌酮的YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后,離心菌液收集沉淀,用液相色譜儀測定2組樣品中的蛋氨酸含量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 δ-10kD-醇溶蛋白基因(zein)序列的獲得

    將δ-10kD-醇溶蛋白基因(GenBank登錄號:NM_001111585.1)原始序列進行優(yōu)化。使用OPTIMWIZ和GENEWIZ軟件提供的基因密碼子優(yōu)化工具進行分析。由圖4可知,經(jīng)OPTIMWIZ分析處理后,CAI從0.65提高至0.96;GC含量和不利的山峰被優(yōu)化,mRNA的半衰期被延長;二級結(jié)構(gòu)以及影響核糖體mRNA的綁定和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)也被移除。根據(jù)優(yōu)化后的zein基因序列合成基因。

    圖4 zein基因密碼子優(yōu)化前后的CAI值、FOP值和GC含量

    2.2 同源整合表達載體的構(gòu)建和鑒定

    分別對利用pUC57-GAP-zein和pBR322質(zhì)粒構(gòu)建的重組載體pBR322-GAP-zein(PGZ),利用 pBR322-GAP-zein(PGZ)和 pMD19-T-mL41 構(gòu)建的重組載體pBR322-GAP-zein-mL41(PGZM),利用 pBR322-GAP-zein-mL41(PGZM)和 pMD19-T-18S rDNA構(gòu)建的重組載體pBR322-GAP-zeinmL41-18S rDNA(PGZM18)進行酶切鑒定,并對回收后的目的片段進行測序鑒定,結(jié)果顯示,同源整合表達載體構(gòu)建成功(見圖5)。

    2.3 產(chǎn)朊假絲酵母放線菌酮抗性試驗

    設(shè)置3個平行試驗組(A、B、C組),觀察產(chǎn)朊假絲酵母菌對不同濃度放線菌酮的敏感性,確定其對放線菌酮的敏感濃度臨界值。由表2可知,產(chǎn)朊假絲酵母菌抗放線菌酮敏感濃度臨界值為20 μg/mL,以該濃度作為后續(xù)試驗放線菌酮工作濃度。

    2.4 產(chǎn)朊假絲酵母重組子鑒定

    將構(gòu)建成功的PGZM18表達載體同源重組到產(chǎn)朊假絲酵母的染色體上,獲得含有目的基因zein的產(chǎn)朊假絲酵母菌株,然后提取重組酵母菌株基因組進行zein目的基因PCR鑒定和測序鑒定。結(jié)果顯示,zein基因被成功整合到產(chǎn)朊假絲酵母染色體上(見圖6),提示含zein基因的產(chǎn)朊假絲酵母基因工程菌構(gòu)建成功。

    表2 不同放線菌酮濃度處理下酵母菌單菌落數(shù)量 個

    圖5 重組載體酶切鑒定結(jié)果

    圖6 酵母重組子PCR鑒定結(jié)果

    2.5 基因工程產(chǎn)朊假絲酵母中的蛋氨酸含量測定

    以未轉(zhuǎn)化zein基因的產(chǎn)朊假絲酵母菌為對照組,以轉(zhuǎn)化zein基因的重組產(chǎn)朊假絲酵母菌為試驗組,測定并比較二者的蛋氨酸表達量。由圖7及表3可知,試驗組的蛋氨酸含量比對照組提高0.24 g/kg(17.14%)。

    3 討論

    圖7 液相色譜法測定氨基酸含量結(jié)果

    表3 蛋氨酸含量測定結(jié)果 g/kg,%

    該試驗采用基因工程技術(shù),將玉米δ-10kD-醇溶蛋白基因(zein),酵母的 GAP 啟動子(GAP-p)、終止子(GAP-t)拼接合成表達框,以18S rDNA片段為整合介導(dǎo)區(qū),應(yīng)用放線菌酮(CYH)抗性基因作為篩選標(biāo)記,結(jié)合pBR322質(zhì)粒構(gòu)建了同源整合表達載體,把zein基因同源重組整合到產(chǎn)朊假絲酵母染色體上,構(gòu)建表達zein蛋白的產(chǎn)朊假絲酵母工程菌株。蛋氨酸含量測定結(jié)果顯示,重組菌株比起始菌株提高了17.14%,接近枯草芽胞桿菌的蛋氨酸表達量[29],但是相較于重組產(chǎn)朊假絲酵母乙醇的產(chǎn)量 29.2 g/L[31]、異丙醇的產(chǎn)量 9.5 g/L[32]還有較大的差距。雖然構(gòu)建的產(chǎn)朊假絲酵母工程菌產(chǎn)蛋氨酸量比較低,但也為下一步提高其蛋氨酸的產(chǎn)量研究打下了良好的基礎(chǔ)。下一步應(yīng)對產(chǎn)朊假絲酵母工程菌的關(guān)鍵調(diào)控基因進行系統(tǒng)的研究,包括提高啟動子的強度、增加目的基因的拷貝數(shù)量、引入信號肽基因及轉(zhuǎn)化方法等。

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