扎布耶鹽山羊金黃色葡萄球菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

何冰梅，馬弘財(cái)，德 吉

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，西藏 拉薩 850000；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009）

葡萄球菌是自然界分布最廣的致病菌，鏡檢時(shí)呈球形，革蘭染色呈陽(yáng)性，常聚集成葡萄串樣，感染動(dòng)物后以體表、皮膚和肌肉出現(xiàn)結(jié)節(jié)性膿皰為特征［1］。羊葡萄球菌病由金黃色葡萄球菌引起羊的葡萄球菌病，損害部位不同，病情不完全一致，經(jīng)破裂和損傷的皮膚、黏膜、汗腺、毛囊感染的羊一般表現(xiàn)毛囊炎、皮下膿腫、脫毛或乳腺炎等，經(jīng)消化道感染可引起食物中毒和胃腸炎，經(jīng)呼吸道感染可引起氣管炎、肺炎［2］。

扎布耶鹽山羊是一種具有耐粗飼、耐高寒、抗缺氧、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性好等獨(dú)特的生理學(xué)特性，其主要生活在西藏仲巴縣帕江鄉(xiāng)海拔為4 400 m左右的扎布耶鹽湖周圍［3-4］。該調(diào)查采集仲巴縣帕江鄉(xiāng)羊場(chǎng)的疑似感染葡萄球菌的病扎布耶鹽山羊膿汁、乳汁、血樣及部分病變組織進(jìn)行金黃色葡萄球菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，以期為地處高海拔的仲巴縣帕江鄉(xiāng)羊場(chǎng)金黃色葡萄球菌病診治提供了診斷方法和治療用藥方案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與地點(diǎn)

1.1.1 病料來(lái)源：據(jù)仲巴縣帕江鄉(xiāng)獸防站工作人員介紹，該鄉(xiāng)帕江鄉(xiāng)羊場(chǎng)放牧羊群中有部分個(gè)體出現(xiàn)消瘦、掉隊(duì)、跛行、關(guān)節(jié)腫脹等癥狀。

2018年5月，針對(duì)仲巴縣帕江鄉(xiāng)羊場(chǎng)的扎布耶鹽山羊開展金黃色葡萄球菌調(diào)查。采集疑似感染金黃色葡萄球菌的病羊局部化膿灶膿汁或羔羊敗血癥的血液［5］、肝臟、脾臟、母羊乳汁［6］，共 117頭份。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

1.1.2.1 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基［7］：取牛肉膏粉3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)pH值至7.2～7.4，121℃高溫高壓滅菌20 min。備用。

1.1.2.2 血瓊脂平皿：取牛肉膏粉3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂粉 15.0 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15分鐘，晾至50～55℃時(shí)，無(wú)菌操作加入100 mL無(wú)菌脫纖維羊血，混勻，傾入無(wú)菌平皿。

1.1.2.3 卻浦曼瓊脂培養(yǎng)基：取明膠30.0 g、氯化鈉 75.0 g、胰蛋白胨 10.0 g、D-甘露醇 10.0 g、酵母浸膏2.5 g、磷酸氫二鉀 5.0 g、硫酸銨75.0 g、瓊脂15.0 g，加熱溶解于 1 000 mL蒸餾水中，調(diào)pH至6.8～7.2，121℃高溫高壓滅菌20 min。備用。

1.1.2.4 BHI培養(yǎng)基［7］：取牛腦浸粉 4.0 g、牛心浸粉4.0 g、蛋白胨 5.0 g、酪蛋白胨 16.0 g、葡萄糖 2.0 g、NaCl 5.0 g、磷酸氫二鈉 2.5 g、瓊脂 15.0 g，加熱攪拌溶解于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)pH至7.2～7.6，121℃高溫高壓滅菌20 min。備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 臨床檢查：觸診檢查消瘦、掉隊(duì)、跛行的發(fā)病羊的腫脹部位。剖檢疑似金黃色葡萄球菌感染的發(fā)病羊，觀察其肝臟、脾臟、腎臟和、股前淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)病變，并無(wú)菌采集肝臟、脾臟、腎臟和股前淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離鑒定。

1.2.2 鏡檢：將采集的病羊局部化膿灶膿汁或羔羊敗血癥的血液、肝臟、脾臟、乳汁，經(jīng)初步涂片鏡檢。

1.2.3 培養(yǎng)：將病料無(wú)菌接種于卻浦曼瓊脂培養(yǎng)基，于（37±1）℃恒溫箱中培養(yǎng) 24 h，將較小的黃色菌落劃線接種于血平板，培養(yǎng)24 h，挑取可疑菌落1個(gè)以上，分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基平板，置于恒溫箱（37±1）℃中培養(yǎng)24 h。

1.2.4 生化鑒定：使用法國(guó)梅里埃VITEK 2 Compact細(xì)菌全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)分離菌株進(jìn)行生化鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)：使用藥物諾氟沙星、氯霉素、慶大霉素、苯唑西林、頭孢西丁、萬(wàn)古霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢拉定、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)如表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

病羊消瘦、掉隊(duì)、跛行，關(guān)節(jié)腫脹，觸診腫脹部位有波動(dòng)感。

表1 藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

2.2 剖檢癥狀

疑似金黃色葡萄球菌感染羔羊，其肝臟、脾臟和腎臟表面有灰白色的壞死點(diǎn)；股前淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)腫大；有大理石樣病變；關(guān)節(jié)腫脹部有膿包。

2.3 病原菌分離

從117頭份樣品中分離出29頭份樣品有如下共性的病原菌：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和BHI培養(yǎng)基平板劃線出現(xiàn)圓形隆起、光滑、濕潤(rùn)菌落。從平板上挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果如圖1所示，該菌呈革蘭氏陽(yáng)性，且無(wú)芽胞、莢膜，圓形，直徑0.5～1 μm，顯微鏡下呈葡萄狀排列，也有個(gè)別2個(gè)或3個(gè)球菌相連。初步判斷該羊場(chǎng)的病羊?yàn)榻瘘S色葡萄球菌感染。

圖1 葡萄球菌鏡檢結(jié)果（100×10油鏡）

2.4 病原菌生化鑒定

將上述分離的菌株經(jīng)梅里埃VITEK 2 Compact細(xì)菌全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)生化鑒定結(jié)果與金黃色葡萄球菌符合率97%［8］，表明該羊場(chǎng)為金黃色葡萄球菌感染。

2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏結(jié)果顯示，對(duì)13種抗生素抑菌圈直徑均為15～20 mm，表明該羊場(chǎng)分離出的金黃色葡萄球菌對(duì)這些抗生素均高度敏感。

3 討論

金黃色葡萄球菌作為一種條件致病菌，在自然界廣泛存在，生活在適宜的條件下，可大量繁殖，引起人和動(dòng)物致?。?］。在臨床上常表現(xiàn)多種類型的感染，如關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、臍炎和葡萄球菌性敗血癥等，給養(yǎng)羊業(yè)造成較大的損失［8］。該調(diào)查研究針對(duì)仲巴縣帕江鄉(xiāng)羊場(chǎng)的扎布耶鹽病羊開展金黃色葡萄球菌調(diào)查，采集的樣品具有針對(duì)性，分離鑒定出的金黃色葡萄球菌檢出率16.24%（19/117），說(shuō)明海拔4 400 m仲巴縣帕江鄉(xiāng)羊場(chǎng)5月存在金黃色葡萄球菌，并能在較為寒冷的季節(jié)繁殖［10］。

生化鑒定的金黃色葡萄球菌，藥敏試驗(yàn)對(duì)諾氟沙星、氯霉素、慶大霉素、苯唑西林、頭孢西丁、萬(wàn)古霉素、氨芐西林、頭孢唑林、頭孢拉定、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星13種抗生素均高度敏感，說(shuō)明在藏西北養(yǎng)羊生產(chǎn)過(guò)程抗生素使用較少，更沒(méi)有濫用藥物治療。

此外，羔羊患有金黃色葡萄球菌病的膿腫較多，大多與羔羊出生時(shí)斷臍不消毒或消毒不徹底，或與橡皮筋斷尾和去勢(shì)引起的轉(zhuǎn)移性膿灶有關(guān)。因此，羔羊出生時(shí)斷臍時(shí)要徹底消毒，對(duì)荊棘叢劃傷的皮膚創(chuàng)傷、頂架創(chuàng)傷等應(yīng)及時(shí)處理，合理用藥，避免濫用抗生素。建議對(duì)發(fā)病羊只進(jìn)行慶大霉素肌肉注射，連用1周。