植物乳桿菌野生質(zhì)粒分析及其提取方法的優(yōu)化

薩初拉，蘇少鋒，吳青海，其布日，高 娃，王蘊(yùn)華，劉紅葵，呼 和

（內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

乳酸菌是已知的益生菌之一，目前被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵和食品工業(yè)及飼料中。隨著研究的深入，利用乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)功能性外源基因已成為研究熱點(diǎn)［1-3］。不同于真核生物表達(dá)系統(tǒng)，細(xì)菌中存在大量的野生型質(zhì)粒，能夠表達(dá)和遺傳如代謝、抗性相關(guān)的基因，因此，挖掘高拷貝、穩(wěn)定復(fù)制的野生型質(zhì)粒元件和無質(zhì)粒受體菌是構(gòu)建細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵［4］。由于乳酸菌為革蘭氏陽性菌，且部分野生型質(zhì)粒拷貝數(shù)低，因此使用傳統(tǒng)堿裂解法或普通質(zhì)粒提取試劑盒提取效果并不理想［4-5］。目前，乳酸菌質(zhì)粒提取方法已有多個(gè)報(bào)道，但操作均過于復(fù)雜、周期長、毒性大、質(zhì)粒產(chǎn)量低且多數(shù)只適合對(duì)數(shù)期乳酸球菌［6-9］，因此，該試驗(yàn)對(duì)比研究已報(bào)道的兩種常規(guī)方法和優(yōu)化后的方法，最終得到可應(yīng)用于平臺(tái)期植物乳桿菌的快速、高效的質(zhì)粒提取方法。利用該方法進(jìn)一步分析野生型植物乳桿菌質(zhì)粒，得到2個(gè)高拷貝質(zhì)粒和1個(gè)無質(zhì)粒受體菌，為進(jìn)一步開發(fā)和利用植物乳桿菌構(gòu)建食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑及材料

1.1.1 菌株：菌株QZ21、QZ56和H18由筆者實(shí)驗(yàn)室分離自玉米秸稈青貯，并通過革蘭氏染色方法、APICH50試紙條、16S rDNA鑒定分類為植物乳桿菌屬。

1.1.2 試劑：DNA分子量Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；溶菌酶，酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）溶液購自生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基購自環(huán)凱微生物科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒提取方法：分別取100 μL QZ21、QZ56和H18植物乳桿菌菌液至10 mL MRS液體培養(yǎng)基，32℃，100 r/min培養(yǎng)過夜至平臺(tái)期。不同方法各取2 mL同一培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒提取對(duì)比分析。

1.2.1.1 質(zhì)粒提取方法Ⅰ：將Klaenhammer等發(fā)表的方法進(jìn)行細(xì)微改動(dòng)。取2 mL過夜培養(yǎng)植物乳桿菌，12 000 r/min離心1 min收集菌體；加入solutionⅠ（25%sucrose，30 mg/mL 溶菌酶）重懸，并置于 37 ℃，孵育 15 min；隨后加入 400 μL SolutionⅡ（3%SDS，0.2 mol/L NaOH），立即混勻，室溫孵育7 min 后； 加入 300 μL 乙酸鈉 （3 mol/L，pH 值4.8），立即混勻，12 000 r/min，離心 15 min；將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管，加入650 μL異丙醇， 混勻，12 000 r/min，4℃離心，15 min； 棄上清液，320 μL ddH2O 重懸沉淀，加入 200 μl 7.5 mol/L乙酸銨和0.5 mg/ml溴化乙錠溶液，混勻，再加入350 μL酚—氯仿溶液，混勻，12 000 r/min離心5 min；將得到的上清用乙醇沉淀，30 μL 1×TE溶解沉淀。

1.2.1.2 質(zhì)粒提取方法Ⅱ：根據(jù)萬謙等［4］發(fā)表的方法。取2 mL過夜培養(yǎng)植物乳桿菌12 000 r/min離心1 min收集菌體；加入250 μL L-P1溶液 （20 mg/mL溶菌酶溶解于P1溶液中）重懸沉淀，37℃處理 30 min；12 000 r/min離心1 min，將上清液完全去除；其余步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。最終產(chǎn)物溶于 30 μL 1×EB。

1.2.1.3 質(zhì)粒提取方法Ⅲ：取2 mL過夜培養(yǎng)植物乳桿菌12 000 r/min離心1 min收集菌體；加入400 μL丙酮混勻；12 000 r/min離心1 min收集菌體。后續(xù)同方法Ⅱ。

1.2.2 質(zhì)粒電泳：各取10 μL上述質(zhì)粒，加入2 μL 6×上樣緩沖液，混勻。使用含有核酸染料的1%瓊脂糖凝膠，以3～4 V/cm進(jìn)行電泳檢測，紫外成像儀進(jìn)行拍照記錄。

1.2.3 定量分析：各取2.5 μL上述質(zhì)粒，使用ddH2O稀釋200倍。使用貝克曼DU640紫外分光光度計(jì)對(duì)260、280 nm處的吸光值進(jìn)行分析，得到其核酸濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒提取結(jié)果

該研究對(duì)比2種常規(guī)乳酸菌質(zhì)粒提取方法，通過提取青貯分離植物乳桿菌野生型質(zhì)粒后進(jìn)行電泳分析，由圖1可知，方法Ⅰ和Ⅱ均能夠檢測到QZ21和QZ56在2 000 bp上下有2條野生型質(zhì)粒條帶，且2種方法得到的條帶并無明顯差異。然而H18菌株除了染色體條帶以外并未檢測到明顯的質(zhì)粒條帶。為進(jìn)一步提高質(zhì)粒提取效率，該研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以簡便、毒性低的方法Ⅱ?yàn)榛A(chǔ)，利用丙酮進(jìn)行前期處理平臺(tái)期植物乳桿菌形成方法Ⅲ，并與方法Ⅰ和Ⅱ進(jìn)行了對(duì)比分析。如圖1所示，方法Ⅲ得到的QZ21和QZ56條帶相對(duì)于方法Ⅰ和Ⅱ更加清晰，說明丙酮前期處理能夠提高植物乳桿菌質(zhì)粒提取效率。但同樣方法Ⅲ提取H18質(zhì)粒后并未檢測到明顯的質(zhì)粒條帶，推測H18可能為無質(zhì)粒植物乳桿菌。

2.2 質(zhì)粒濃度結(jié)果

圖1 質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果

表1 紫外分光光度計(jì)分析質(zhì)粒濃度結(jié)果

為進(jìn)一步量化質(zhì)粒提取結(jié)果，該試驗(yàn)采用紫外分光光度計(jì)測量相同體積質(zhì)粒提取物中的DNA含量。測得結(jié)果如表1所示，方法Ⅰ所得到的質(zhì)粒提取物中總的DNA含量明顯高于方法Ⅱ，但從電泳結(jié)果可知方法Ⅰ所得質(zhì)粒提取物中基因組DNA的污染比例明顯高于方法Ⅱ，說明方法Ⅰ所得質(zhì)粒提取物中純質(zhì)粒的含量較少。同樣改良后的方法Ⅲ的質(zhì)粒提取物中基因組DNA的比例也較高，可能由于丙酮前期處理后增加了細(xì)菌的裂解率，從而也提高了質(zhì)粒的提取率。由于常規(guī)質(zhì)粒提取過程中無法完全排除細(xì)菌基因組的污染，尤其是在革蘭氏陽性細(xì)菌質(zhì)粒提取過程中，所以只能在保證質(zhì)粒提取量的前提下，盡量減少基因組的污染。

3 討論

質(zhì)粒提取效率受到細(xì)菌濃度、生長時(shí)期、提取方法、質(zhì)粒濃度和物種等多個(gè)因素的影響［10］。目前已有多個(gè)有效乳菌質(zhì)粒提取方法的報(bào)道［4-9］。其中多數(shù)均以乳酸菌為研究對(duì)象［4-5，7-8］，而植物乳桿菌質(zhì)粒提取有效方法報(bào)道較少，且多數(shù)研究使用對(duì)數(shù)生長期的乳酸菌［4-8］，然而獲得對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌時(shí)需要不斷監(jiān)測，且需要大量的培養(yǎng)物來達(dá)到所需的質(zhì)粒提取量。平臺(tái)期培養(yǎng)物通常可以從過細(xì)菌液培養(yǎng)物得到，并且菌液濃度也會(huì)最大，因此如果能利用平臺(tái)期植物乳桿菌進(jìn)行有效質(zhì)粒提取，則能夠節(jié)省人力的同時(shí)，保障得到高濃度質(zhì)粒。植物乳桿菌野生型質(zhì)粒的拷貝數(shù)較低，且平臺(tái)期細(xì)胞膜較厚，因此常規(guī)方法很難有效裂解平臺(tái)期植物乳桿菌細(xì)胞壁，需要對(duì)現(xiàn)有方法進(jìn)行改進(jìn)，從而獲得可廣泛應(yīng)用于平臺(tái)期植物乳桿菌的快速、高效質(zhì)粒提取方法。

由上述電泳及紫外定量結(jié)果可知，所得到的質(zhì)粒濃度依照使用方法不同而不同。其中方法Ⅲ得到的DNA濃度最大，其次方法Ⅰ，而方法Ⅱ得到的DNA濃度最低。方法Ⅲ具有高效率的首要原因可能是在質(zhì)粒提取過程中使用了強(qiáng)通透劑——丙酮。這一過程大大增加了植物乳桿菌細(xì)胞壁通透性，從而為溶菌酶進(jìn)一步裂解細(xì)胞壁提供了良好的基礎(chǔ)［9］。利用方法Ⅰ檢測植物乳桿菌質(zhì)粒通常是可行的，但由于方法Ⅰ操作過程過于復(fù)雜，并且存在EB污染風(fēng)險(xiǎn)，因此并不利于常規(guī)操作。方法Ⅱ應(yīng)用于乳酸球菌質(zhì)粒提取時(shí)具有很高的效率，但應(yīng)用于植物乳桿菌質(zhì)粒提取過程中時(shí)卻不盡人意。由此可知，并非所有乳酸球菌質(zhì)粒提取方法均適用于其他乳酸菌的質(zhì)粒提取，因此，需要依照不同的物種，對(duì)質(zhì)粒提取方法進(jìn)行優(yōu)化及改進(jìn)。方法Ⅰ得到的DNA總濃度雖然比方法Ⅱ得到的大，但依照電泳結(jié)果可知方法Ⅰ得到的質(zhì)粒提取物中基因組DNA污染較大，而方法Ⅱ使用了過柱純化方法，因此有效降低了基因組DNA的污染比例。

該研究為建立快速有效的植物乳桿菌質(zhì)粒提取方法，在方法Ⅱ的基礎(chǔ)上增加了丙酮處理過程，從而提高了植物乳桿菌質(zhì)粒獲得率，建立了適合于平臺(tái)期植物乳桿菌快速、高效質(zhì)粒提取方法。利用該方法進(jìn)一步分析野生型植物乳桿菌QZ21、QZ56和H18的質(zhì)粒，得到2個(gè)高拷貝質(zhì)粒和1個(gè)無質(zhì)粒植物乳桿菌。其中高拷貝質(zhì)?？梢愿脑鞛楸磉_(dá)載體，而無質(zhì)粒植物乳桿菌可以作為方便的受體菌株。

由于乳酸菌的益生作用和食品領(lǐng)域應(yīng)用潛力，目前已被越來越多的研究團(tuán)隊(duì)所關(guān)注。如何開發(fā)利用乳酸菌作為轉(zhuǎn)基因技術(shù)、制藥、食品加工及飼料等領(lǐng)域的生物媒介是關(guān)鍵。其中乳酸菌工程菌的制備及相應(yīng)載體的構(gòu)建是基礎(chǔ)，然而在此過程中，乳酸菌質(zhì)粒提取是重要的技術(shù)手段。乳酸球菌質(zhì)粒提取方法雖然已被廣泛報(bào)道，但植物乳酸桿菌質(zhì)粒的快速、高效提取方法仍需進(jìn)一步優(yōu)化。該試驗(yàn)中，通過對(duì)比分析不同試驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化，得到了快速有效的植物乳桿菌質(zhì)粒提取方法，最終利用該方法獲得了構(gòu)建植物乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)所需高拷貝質(zhì)粒和受體菌株，為構(gòu)建植物乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。