二代測(cè)序技術(shù)在Alport綜合癥應(yīng)用中的新進(jìn)展

牛琛皓 高霞

【摘 要】 Alport綜合征（Alport syndrome，AS）是一種遺傳性腎病， 是由編碼α3、α4、α5（IV）膠原三聚體的COL4A3，COL4A4或COL4A5基因突變引起的。AS目前仍缺乏有效的治療措施，故對(duì)AS早期確診、治療、延緩進(jìn)展以及提供AS家系遺傳學(xué)分析，減少遺傳風(fēng)險(xiǎn)意義重大。隨著二代測(cè)序技術(shù)的成熟與廣泛應(yīng)用，為尚未發(fā)現(xiàn)熱點(diǎn)突變的AS患者基因測(cè)序及診斷提供了新方法。同時(shí)針對(duì)罕見(jiàn)病，建立生物樣本庫(kù)也是未來(lái)罕見(jiàn)病研究發(fā)展趨勢(shì)。本文將重點(diǎn)介紹二代測(cè)序技術(shù)近年來(lái)在AS應(yīng)用及診斷中的進(jìn)展情況。

【關(guān)鍵詞】 Alport綜合征；COL4A3；COL4A4；COL4A5；二代測(cè)序技術(shù)；生物樣本庫(kù)

【中圖分類(lèi)號(hào)】

R969.4 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】

A 【文章編號(hào)】1005-0019（2018）21-292-02

1 引言

Alport綜合征（Alport syndrome，AS）是一種進(jìn)行性的遺傳性腎小球疾病，表現(xiàn)為鏡下血尿或肉眼血尿，可伴有蛋白尿，聽(tīng)力及視力下降，可進(jìn)展至終末期腎病[1]，其發(fā)病率約為1/5000，在導(dǎo)致兒童慢性腎功能衰竭的病因中約占3.0%[3]。

AS是由編碼α3、α4、α5（IV）膠原異源三聚體的COL4A3，COL4A4或COL4A5基因突變引起的遺傳性疾病，其中α3、α4 基因突變所致為常染色體顯性或隱性遺傳，α5鏈基因突變所致為X染色體連鎖的顯性遺傳[4-5]。COL4An（n為3、4或5）突變形式多種多樣，尚未發(fā)現(xiàn)熱點(diǎn)突變。目前報(bào)道顯示突變類(lèi)型以點(diǎn)突變，小的缺失最為常見(jiàn)，其他的有插入、重排等[6-7]。通過(guò)免疫熒光檢查突變所致的Ⅳ型膠原鏈的異?？梢栽\斷AS，但部分突變形成的異常Ⅳ型膠原鏈免疫熒光無(wú)法顯示，此時(shí)就要從基因診斷方面研究。第二代測(cè)序（next-generation sequencing， NGS）技術(shù)的發(fā)展與成熟，為AS的基因診斷及AS患者基因突變篩查提供了新的方法。

2 AS目前的診斷方法（體系）

20世紀(jì)80年代，診斷AS多采用Flinter等提出的“四項(xiàng)診斷指標(biāo)”，簡(jiǎn)便，但不能做到確診，更沒(méi)有遺傳學(xué)提示。之后Gregory等提出AS診斷十條標(biāo)準(zhǔn)，全面但十分繁瑣。再到目前的診斷方法：（1）腎活檢電鏡檢查可見(jiàn)GBM出 現(xiàn)特異性的超微病理病變；（2）皮膚基底膜（IV）鏈表達(dá)異常，有些情況下還要結(jié)合腎組織基膜僅（IV）鏈的表達(dá)；（3）COL4An基因突變。

3 NGS技術(shù)特點(diǎn)及在AS中的應(yīng)用價(jià)值

NGS技術(shù)特點(diǎn)：（1）高通量。可對(duì)芯片上數(shù)百萬(wàn)個(gè)點(diǎn)同時(shí)測(cè)序；（2）成本低。

NGS技術(shù)每Mb堿基成本比Sanger測(cè)序顯著降低；（3）敏感性高，能保證對(duì)低豐度DNA信息的檢測(cè)。

AS致病基因COL4A5（51個(gè)外顯子）、COL4A3（52個(gè)外顯子）和COL4A4（48個(gè)外顯子），未發(fā)現(xiàn)突變熱點(diǎn)，采用傳統(tǒng)PCR方法測(cè)序費(fèi)時(shí)費(fèi)力成本高昂。提取患者皮膚標(biāo)本培養(yǎng)成纖維細(xì)胞應(yīng)用RT—RCR測(cè)序方法來(lái)檢測(cè)COL4A5基因在某些無(wú)義突變介導(dǎo)的mRNA降解或外顯子大片段缺失等情況下可導(dǎo)致突變檢測(cè)失敗。

而NGS技術(shù)可在同一張芯片上高特異性和高覆蓋率捕獲研究者感興趣的目標(biāo)外顯子區(qū)域，從而篩選出突變。

4 目前報(bào)道的運(yùn)用二代測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)

2017年一西班牙AS家系中，研究者應(yīng)用NGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變COL4A3基因外顯子18中的p.G333E，外顯子48中的Pro-Leu置換（p.P1461L），外顯子49中的Ser-Cys替代（p.S1492C），以及COL4A3基因中p.G333E和p.P1461L或p.S1492C突變的攜帶者比僅攜帶p.G333E突變的攜帶者臨床癥狀更加嚴(yán)重，發(fā)病更早。2017年中國(guó)一AS家系報(bào)道中發(fā)現(xiàn)COL4A5突變類(lèi)型中無(wú)義突變和甘氨酸替代比其他錯(cuò)義突變臨床表現(xiàn)更嚴(yán)重，COL4A5中由酸性氨基酸取代甘氨酸引起的臨床表型更為嚴(yán)重。同年，意大利一AS家系報(bào)道中，研究者應(yīng)用NGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)c.2245-40A>G等位基因的X染色體滅活與雜合子女性中的疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。使用常用生物信息分析軟件結(jié)果趨向于雜合A→G這種氨基酸置換具有有害性。2016年研究人員在希臘家族性微血管畸形的研究中發(fā)現(xiàn)患有COL4A3/A4基因雜合突變的患者可能會(huì)被誤診為FSGS（局灶性節(jié)段性腎小球硬化）。發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變COL4A5-p.C1567R，以及突變COL4A4-p.G748S，COL4A4-p.G774R和p.G1465D在兩個(gè)不相關(guān)的家庭中具有普遍性。

5 利用NGS技術(shù)研究AS及慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）的潛力（建立AS及慢性腎臟病生物信息樣本庫(kù)）

生物樣本庫(kù)是一種應(yīng)用于支持遺傳研究的結(jié)構(gòu)化資源，共有2種類(lèi)型：（1）人口生物樣本庫(kù)（population—based biobank）；（2）疾病生物樣本庫(kù)（disease—oriented biobank）；建立CKD及AS患者生物信息樣本庫(kù)，可獲得大量生物信息，加以處理分析得出生物信息學(xué)數(shù)據(jù)可運(yùn)用在疾病的干預(yù)與管理。運(yùn)用NGS技術(shù)可有針對(duì)性的選取所要研究的遺傳性疾病的生物信息，快速建立對(duì)應(yīng)疾病的生物信息樣本庫(kù)。

結(jié)語(yǔ)

AS是進(jìn)行性、終生性的，盡早確診有利于AS患者及家族成員得到有針對(duì)性的干預(yù)和治療。NGS技術(shù)運(yùn)用于AS的基因診斷是很有意義的，并且可便于區(qū)分TBMD（腎小球薄基底膜?。┗駻S，代表著未來(lái)AS的診斷方向。以NGS技術(shù)獲取大數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)建立AS的生物信息樣本庫(kù)，將為今后AS的多領(lǐng)域研究提供數(shù)據(jù)支撐。

參考文獻(xiàn)

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