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    辛基功能化離子液體鍵合硅膠固相萃取海水中貝類毒素的方法研究

    2020-02-06 03:48:57孫曉杰丁海燕譚杰邢鈞郭萌萌邢麗紅李兆新翟毓秀
    分析化學(xué) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:混合模式離子液體固相萃取

    孫曉杰 丁海燕 譚杰 邢鈞 郭萌萌 邢麗紅 李兆新 翟毓秀

    摘 要 貝類毒素(Shellfish toxins)是重點(diǎn)監(jiān)控的海洋污染物。本研究通過將辛基功能化離子液體接枝到硅膠表面,制備了一種混合模式的共價鍵合硅膠材料 (Silica-[SOIM\][PF6\]),利用紅外光譜、核磁共振和元素分析進(jìn)行了表征。采用自制材料填制固相萃取柱,通過固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(SPE-LC-MS/MS)技術(shù)對海水中貝類毒素(大田軟海綿酸毒素(OA)、鰭藻毒素-1 (DTX-1)和鰭藻毒素-2 (DTX-2))進(jìn)行富集檢測。研究發(fā)現(xiàn),此固相萃取材料與目標(biāo)貝類毒素可能存在疏水作用和離子交換作用等多重相互作用。分別對進(jìn)樣溶液的體積和pH值、淋洗劑和洗脫劑的種類、用量以及pH值范圍等因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,此固相萃取材料對海水中3種貝類毒素具有良好的萃取效果,優(yōu)于或與商用化萃取材料性能相當(dāng),檢出限(LOD)為0.01 μg/L,定量限(LOQ)為0.05 μg/L,在0.02~2.50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.995),回收率在93.0%~116%之間。同時,材料具有良好的重現(xiàn)性,批內(nèi)和批間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。本方法準(zhǔn)確、靈敏、簡便、可靠,可用于實(shí)際樣品中貝類毒素的萃取檢測。

    關(guān)鍵詞 離子液體; 固相萃取; 混合模式; 貝類毒素; 海水

    1 引 言

    我國是世界上最大的貝類養(yǎng)殖國。海洋中有毒微藻或微生物產(chǎn)生的貝類毒素,可污染海洋水體和海洋生物,并主要在雙殼貝類中富集,可經(jīng)食物鏈濃縮放大上萬倍,最終危害人類的生存和健康[1~5]。貝類毒素已成為發(fā)達(dá)國家制定貿(mào)易和技術(shù)壁壘的重要指標(biāo)。歐盟指令(EC)No.15/2011規(guī)定小鼠生物法測定貝類毒素含量作為官方標(biāo)準(zhǔn)于2014年以后停用,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)作為取代方法,可對單個組分分別進(jìn)行定性和定量分析,已成為監(jiān)測貝類毒素的重點(diǎn)發(fā)展方法[6~12],并建立了相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)[13]。然而,由于貝類毒素結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類較多,提取富集等前處理技術(shù)成為限制其準(zhǔn)確定量分析的主要瓶頸。為更好地評價貝類毒素對海洋生態(tài)的影響,監(jiān)控赤潮等有毒藻類爆發(fā),保障貝類等水產(chǎn)品的質(zhì)量安全,亟需開發(fā)更有效的前處理方法和更靈敏的檢測技術(shù)。

    固相萃取是復(fù)雜樣品富集凈化的常用前處理技術(shù),目前,用于污染物富集純化的商用固相萃取柱與萃取對象作用模式單一。針對復(fù)雜樣品中的多種組分分別提取純化,步驟繁多, 耗時費(fèi)力, 成本較高,同時耗用大量有機(jī)試劑,造成嚴(yán)重環(huán)境污染。因此,亟需研發(fā)含多種官能團(tuán)的混合模式固相萃取材料,實(shí)現(xiàn)對樣品中復(fù)雜多組分同時富集純化, 提高分離檢測效率。離子液體(Ionic liquids, ILs)是一種新型的萃取材料,憑借良好的熱穩(wěn)定性、低可燃性、不易揮發(fā)及低毒性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于色譜樣品的前處理[14,15]。經(jīng)過多年研究,離子液體色譜材料的選擇性能得到了逐步改善。將離子液體鍵合固定到載體上,可得到具有離子液體功能結(jié)構(gòu)的固相萃?。⊿olid phase extraction, SPE)新材料。目前,固定化的離子液體多用于液相色譜柱[16~18]、氣相色譜柱[19,20]及毛細(xì)管電色譜柱[21,22]的固定相,極少作為固相萃取吸附劑使用。Tian等[23] 于2009年首先提出了離子液體固相吸附劑的研究方案,與離子液體-液液萃取相比,可有效克服離子液體粘度大、不易操作等缺點(diǎn),同時增大了被分離物質(zhì)與離子液體的接觸面積,在痕量組分的分離富集中具有良好的應(yīng)用前景。固定化離子液體的相關(guān)研究起步較晚,主要用于萃取分離常見有機(jī)污染物[24,25]。離子液體固相萃取材料可在保留原有固相載體性質(zhì)的基礎(chǔ)上,同時發(fā)揮離子液體的特異選擇性。另外,萃取材料可再生重復(fù)利用,將有效減少離子液體的使用量,增加萃取材料的使用率,降低前處理成本。因而,制備新型的離子液體固相萃取材料,是發(fā)展高效萃取技術(shù)的重要途徑之一。

    本研究通過接枝方法將辛基功能化離子液體固定到硅膠載體上,即形成離子液體共價鍵合硅膠材料,是具有混合模式的功能化萃取材料,可實(shí)現(xiàn)對樣品中多性質(zhì)組分分離純化的目標(biāo)。由于離子液體具有大體積的陽離子和小體積的陰離子,與偏酸性目標(biāo)物可能存在陰離子交換作用。因此,選擇3種弱酸性貝類毒素(大田軟海綿酸毒素(Okadaic acid, OA)、鰭藻毒素-1 (Dinophysistoxin-1, DTX-1)和鰭藻毒素-2 (Dinophysistoxin-2, DTX-2))作為目標(biāo)物,將ILs-SPE技術(shù)應(yīng)用于海水樣品中OA、DTX-1和DTX-2的富集和凈化。優(yōu)化了進(jìn)樣溶液的體積和pH值、淋洗劑和洗脫劑的種類、用量及pH值等條件,考察了各種因素對萃取效果的影響,評價了檢測方法的可行性和重現(xiàn)性。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    TSQ Quantum AccessTM 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司); Kinetex XB C18色譜柱(150 mm × 2.1 mm,4 μm,美國Phenomenex公司); XW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠); Milli-Q型超純水儀(美國Millipore公司); Thermo Sorvall Biofuge Primo型離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific 公司); Karlsruhe紅外光譜儀、Avance II spectrometer核磁共振儀(德國Brucker公司); Vario EL cube元素分析儀(德國Elementar公司)。Oasis HLB固相萃?。⊿PE)柱(3 mL, 60 mg,美國Waters公司)和C18固相萃取柱(3 mL,60 mg,天津博納艾杰爾科技有限公司)。

    OA和DTX-1標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%,臺灣Algal Science公司); DTX-2標(biāo)準(zhǔn)溶液((4.7±0.3) μg/mL, 加拿大海洋生物科學(xué)研究所); 甲醇 (色譜純,德國Merck公司); 乙腈(色譜純,德國CNW公司); 甲酸、甲酸銨(色譜純,德國Fluka公司); 1-芐基咪唑(色譜純,F(xiàn)luka公司); 六氟磷酸鉀(色譜純,J&K Chemical公司)。 其余溶劑和試劑均為分析純, 實(shí)驗(yàn)用水為來自Milli-Q超純水系統(tǒng)的超純水。

    混合標(biāo)準(zhǔn)使用液:分別稱取適量的OA和DTX-1標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇定容,配制成10.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18℃避光保存。準(zhǔn)確吸取適量的OA、DTX-1和DTX-2標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用甲醇配制1.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-18℃避光保存。

    2.2 儀器條件和參數(shù)

    柱溫:35℃; 流速:0.3 mL/min; 進(jìn)樣量:10 μL; 流動相,A:2 mmol/L 甲酸銨溶液,B:乙腈-2 mmol/L甲酸銨溶液 (95∶5, V/V),梯度洗脫程序:0 min,30% B; 0~3.00 min,30%~90% B; 3.00~6.00 min,90% B; 6.00~6.01 min, 90%~30% B; 6.01~8.00 min, 30% B 。

    電噴霧電離源(ESI),多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)離子模式; 負(fù)離子監(jiān)測; 噴霧電壓為4000 V; 鞘氣和輔助氣體均為高純氮?dú)猓蕷鈮毫Γ?6 L/min,輔助氣壓力:10 L/min,碰撞氣為氦氣; 離子傳輸桿溫度為350℃。碰撞能(Collision energy)及其它相關(guān)質(zhì)譜條件見表1。

    2.3 辛基離子液體鍵合硅膠(Silica-[SOIM\][PF6\])的制備

    離子液體及鍵合硅膠的制備過程參照圖1。

    2.3.1 辛基咪唑的合成 將體積分?jǐn)?shù)為36%甲醛(8.35 g)和體積分?jǐn)?shù)為32%乙二醛(18.1 g)加入250 mL三口燒瓶中,攪拌加熱至50℃回流,然后分別將體積分?jǐn)?shù)28%氨水(6.05 g)和辛胺的甲醇溶液(12.9 g溶于50 mL甲醇)逐滴加入到三口燒瓶,加完后繼續(xù)回流反應(yīng)4 h,純化干燥得到淡黃色辛基咪唑產(chǎn)品。

    2.3.2 硅烷基辛基咪唑氯鹽的合成 將γ-氯丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液(0.08 mol, 15.9 g,溶于25 mL甲苯)加入三口燒瓶中, 將2.3.1節(jié)制得的辛基咪唑(0.08 mol, 14.4 g)加入溶解并攪拌均勻,在氮?dú)鈿夥障禄亓?8 h,產(chǎn)物純化干燥得到粘稠狀淡黃色液體, 即硅烷基辛基咪唑氯鹽([SOIM\][Cl\])。

    2.3.3 硅烷基辛基咪唑六氟磷酸鹽的合成 將硅烷基辛基咪唑氯鹽的甲醇溶液(0.05 mol, 18.9 g, 溶于25 mL甲醇中)加入圓底燒瓶中,同時將等摩爾的KPF6溶于甲醇(0.05 mol, 9.20 g, 溶于10 mL甲醇),將兩種溶液混合,室溫攪拌反應(yīng)24 h,得到淡黃色沉淀; 純化干燥得到粘稠狀淡黃色液體, 即硅烷基辛基咪唑六氟磷酸鹽( [SOIM\][PF6\] )。

    2.3.4 離子液體鍵合硅膠的制備 選擇粒徑200~300目的硅膠粉,通過一定濃度的HCl或甲烷磺酸酸化,使硅膠外表面帶有羥基,調(diào)節(jié)pH至中性后高溫干燥,備用。稱取約2 g辛基離子液體[SOIM\][ PF6]溶于10 mL乙腈,再加入HCl處理的硅膠(40~60目)約4 g,氮?dú)獗Wo(hù)下回流反應(yīng)24 h后; 將反應(yīng)液過濾,用乙腈和去離子水沖洗去除殘留物,80℃真空干燥5 h,得到淡黃色離子液體鍵合硅膠Silica-[SOIM\][PF6\],產(chǎn)率約80%。

    2.4 離子液體鍵合材料性能分析

    通過多種儀器分析商用硅膠和離子液體鍵合硅膠的結(jié)構(gòu)、構(gòu)型以及二者的差異。首先通過紅外光譜表征比較鍵合離子液體前后硅膠材料官能團(tuán)結(jié)構(gòu)的變化; 其次,采用核磁共振技術(shù)于確定功能化離子液體的結(jié)構(gòu); 然后,通過元素分析,得到離子液體鍵合硅膠材料中C、H、N元素的百分含量,并計算硅膠表面離子液體的鍵合含量。

    2.5 固相萃取柱的制備

    選用固相萃取柱的柱管體積為3 mL,柱管材料為聚丙烯,進(jìn)出口篩板選用高純度聚乙烯材料(直徑6.4 mm,孔徑20 μm,厚度1.5 mm),內(nèi)部填充固相萃取填料選用自制的Silica-[SOIM\][PF6\](50 mg,粒徑40~60 μm)。先在空柱管底部放入出口篩板,然后裝入自制離子液體鍵合硅膠層,輕輕敲打使其分布均勻,其上垂直壓入進(jìn)口篩板,最后用甲醇沖洗填實(shí),并保證所有小柱填充后,填料高度保持(5±0.05)mm。

    2.6 樣品處理

    海水水樣用0.45 μm濾膜過濾,除去懸浮顆粒。固相萃取柱使用前,分別用2.0 mL甲醇和2.0 mL 50 mmol/L乙酸銨活化,棄去流出液。取20 mL過濾后的海水樣品,以約5.0 mL/min流速通過活化的固相萃取小柱進(jìn)行富集。用2.0 mL 50 mmol/L乙酸銨淋洗,減壓抽干后, 用3.0 mL 體積分?jǐn)?shù)為5%的NH4OH-甲醇洗脫,洗脫液在40℃下氮?dú)獯蹈桑?用0.5 mL初始流動相復(fù)溶,充分渦旋溶解殘?jiān)?濾液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 紅外光譜分析

    紅外光譜(IR)是提供結(jié)構(gòu)和構(gòu)象信息的有力工具[26,27]。 對離子液體[SOIM\][PF6\]的紅外光譜表征發(fā)現(xiàn),3127和3059 cm-1對應(yīng)于咪唑環(huán)上CH的伸縮振動,2958、2932和2868 cm-1對應(yīng)于甲基和亞甲基的伸縮振動,1156 cm-1對應(yīng)于SiC的伸縮振動,1083 cm-1和1023 cm-1對應(yīng)于SiO的伸縮振動,證明存在硅烷基。

    與未修飾的商用硅膠材料相比,制備的離子液體鍵合硅膠在1570 cm-1處出現(xiàn)了一個弱峰(圖2)。因?yàn)轷0坊奶卣鞣逄幱?500~1600 cm-1之間[28],這說明一些帶有CN基團(tuán)的離子液體與商用硅膠有效的化學(xué)鍵合生成了新的物質(zhì)。上述結(jié)果表明成功制備了功能化離子液體鍵合硅膠。

    3.2 核磁共振譜分析

    離子液體[SOIM\][PF6\]核磁共振分析結(jié)果如下: 1H-NMR (DMSO, 不含TMS; 400 MHz; δ ppm): 9.16 (s, 1H), 7.78 (m, 2H), 4.15 (m, 4H), 3.47 (m, 9H), 1.85 (m, 4H), 1.25 (m, 10H), 0.86 (t, 3H), 0.54(m, 2H)。其中, 9.16和7.78對應(yīng)咪唑環(huán)上的H的位移, 4.15對應(yīng)與咪唑環(huán)相連的兩個亞甲基上H的位移,3.47對應(yīng)硅烷基上H的位移, 1.85對應(yīng)與咪唑環(huán)相連的第二個亞甲基H的位移,1.25對應(yīng)辛基取代基上5個亞甲基H的位移,0.86對應(yīng)辛基取代基上甲基H的位移,0.54對應(yīng)于與硅烷基相連的亞甲基H的位移。結(jié)果表明,成功制備了辛基功能化離子液體。

    3.3 元素分析

    對修飾前后的硅膠材料進(jìn)行元素分析,未修飾硅膠中只測得H元素的含量(0.983%),辛基功能化離子液體修飾后,N、C和H元素的質(zhì)量百分含量分別為2.73%、9.65%和2.07%,說明離子液體成功修飾到硅膠上,并可根據(jù)N元素的含量推算出1 g硅球表面有機(jī)基團(tuán)鍵合量,對應(yīng)辛基功能化離子液體的鍵合量為1.95 mmol。

    3.4 固相萃取條件優(yōu)化

    采用制備的辛基離子液體鍵合硅膠Silica-[SOIM\][PF6\]填制固相萃取柱(3 mL,50 mg),用于富集凈化水中3種貝類毒素OA、DTX-1和DTX-2。采用空白基質(zhì)加標(biāo)方式(0.5 μg/L),對影響萃取效率和回收率的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,包括樣品預(yù)處理?xiàng)l件、樣品溶液進(jìn)樣條件、雜質(zhì)淋洗條件和目標(biāo)物洗脫條件,每個條件下做6個平行實(shí)驗(yàn)。

    3.4.1 進(jìn)樣溶液體積的影響 固相萃取填料有載樣上限,超負(fù)荷進(jìn)樣,會影響目標(biāo)物的回收率和凈化效果。取適量貝類毒素(OA、DTX-1和DTX-2)混合加標(biāo)濃度為0.5 μg/L的海水進(jìn)行分析,研究不同進(jìn)樣體積(5、10、20、30和50 mL)對萃取效果的影響(本研究部分均采用2.0 mL純水淋洗,2.0 mL甲醇洗脫),結(jié)果見圖3。

    根據(jù)公式(1)計算富集倍數(shù)(EFs):

    EFs =Ct/C0 = (nt/Vt)/C0(1)

    其中,Ct為最終樣品溶液中目標(biāo)物濃度,C0為初始樣品溶液中目標(biāo)物濃度,nt為目標(biāo)物最終摩爾量,Vt為最終定容溶液體積。

    當(dāng)最終定容溶液體積Vt和初始樣品溶液濃度C0確定后,進(jìn)樣量越大,對應(yīng)最終摩爾量nt越大,富集倍數(shù)越高,方法靈敏度越好。然實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),隨著進(jìn)樣體積增大,引入雜質(zhì)增多,對目標(biāo)物的干擾增大,且進(jìn)樣速度變緩,50 mL整體進(jìn)樣時間超過0.5 h, 增大了凈化難度。綜合考慮方法的前處理效率和靈敏度,最終選擇進(jìn)樣體積為20 mL。

    3.4.2 進(jìn)樣溶液pH值的影響 辛基離子液體鍵合硅膠Silica-[SOIM\][PF6\]含有陰陽離子基,可能與目標(biāo)貝類毒素發(fā)生疏水作用、離子交換作用和靜電作用等多種模式作用。如圖4所示,3種貝類毒素的結(jié)構(gòu)中都含有羧基,在不同pH值條件下穩(wěn)定態(tài)不同,可能影響其回收率。分別通過甲酸和氨水調(diào)整進(jìn)樣海水pH值,取20 mL海水進(jìn)樣,比較了pH 5.5(5%甲酸)、pH 10.5(5%氨水)、pH 7.0和8.0(常規(guī)海水pH值為7.5~8.3)的貝毒加標(biāo)海水樣品(0.5 μg/L)的回收率(均采用2.0 mL純水淋洗,2.0 mL甲醇洗脫)。結(jié)果表明,當(dāng)進(jìn)樣液pH值為7.0和8.0時,目標(biāo)貝類毒素的回收率均大于80%(圖5),明顯高于弱酸(pH 5.5)和弱堿(pH 10.5)條件,說明離子交換作用可能不是Silica-[SOIM\][PF6]型小柱與貝類毒素間的主要作用力。為操作方便和方法的可重復(fù)性,海水樣品可采取直接萃取富集,不調(diào)整pH值的方式。

    3.4.3 淋洗溶劑的影響 對復(fù)雜基質(zhì)樣品,為排除基質(zhì)干擾及提高檢測靈敏度,洗脫目標(biāo)物之前需增加淋洗步驟。由于硅膠表面修飾了離子液體,同時檢測對象為海水樣品,沸點(diǎn)高且鹽含量較高,為避免對質(zhì)譜儀器造成污染,固相萃取過程的第一步淋洗劑采用純水,可去除大量水溶性干擾物。取20 mL貝類毒素(OA、DTX-1和DTX-2)混合加標(biāo)濃度為0.5 μg/L的海水進(jìn)樣,分別評價了30%甲醇、純水和50 mmol/L乙酸銨溶液作為淋洗液的凈化效果和回收率(2.0 mL甲醇洗脫)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),30%甲醇和純水淋洗時,3種貝類毒素都有不同程度損失,說明離子交換作用可能不是自制Silica-[SOIM\][PF6\]柱與目標(biāo)貝類毒素間的主要作用力。當(dāng)使用50 mmol/L乙酸銨作為淋洗液時,目標(biāo)貝類毒素的回收率最高、損失最小。此外,為確定淋洗液的用量,考察了不同體積(1.0~6.0 mL)淋洗液的效果,當(dāng)體積小于2.0 mL時,隨淋洗液用量增加,洗出液的干擾量逐漸增大; 當(dāng)淋洗液大于2.0 mL后,不再出現(xiàn)干擾峰。因此,選擇2 mL 50 mmol/L乙酸銨作為后續(xù)研究的淋洗劑。

    3.4.4 洗脫溶劑的影響 如圖4所示,3種目標(biāo)貝類毒素結(jié)構(gòu)中都含有羧基基團(tuán),屬于弱酸性物質(zhì)。考慮到Silica-[SOIM\][PF6\]上咪唑基的弱堿性,適當(dāng)pH值的洗脫溶劑可使辛基離子液體鍵合硅膠Silica-[SOIM\][PF6\]或目標(biāo)貝類毒素變?yōu)橹行裕瑥亩赡艽蚱莆絼┡c目標(biāo)分子間的相互作用力。因此,洗脫溶劑pH值可能是影響貝類毒素從Silica-[SOIM\][PF6\]柱上洗脫效果的重要因素。以5% NH4OH-甲醇、2% HAc-甲醇和純甲醇作為洗脫溶劑進(jìn)行了初步測試。結(jié)果表明(表2),采用純甲醇洗脫時,3種貝類毒素的回收率均大于85%,推測Silica-[SOIM\][PF6\]材料的保留性能同反相C18小柱相似,與目標(biāo)貝類毒素間存在疏水作用力; 另外,5% NH4OH-甲醇洗脫不僅能得到無色、澄清的流出液體,而且回收率優(yōu)于2% HAc-甲醇和純甲醇,推測Silica-[SOIM\][PF6\]材料與3種貝類毒素間同時存在陰離子交換作用,部分以陰離子狀態(tài)存在的貝類毒素轉(zhuǎn)化成分子形式被洗脫下來。

    因此,選擇含有NH4OH的甲醇溶劑洗脫分析物。在此基礎(chǔ)上,考察甲醇中NH4OH含量(0%、2%、5%和10%)對回收率的影響。結(jié)果表明,NH4OH含量從0增加到5%,3種分析物的回收率迅速增加,當(dāng)濃度進(jìn)一步增加

    [FQ(72。242,Y-WZ][HT5”SS][HJ*4]表2 不同洗脫溶劑對貝類毒素各組分回收率的影響到10%時,回收率增大幅度變慢。因此,選擇5% NH4OH-甲醇作為洗脫溶劑。對洗脫劑體積進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明, 3 mL 5% NH4OH-甲醇即可充分洗脫分析物,過量會延長氮吹濃縮時間。因此,選擇洗脫體積為3 mL。

    3.5 與商用萃取柱比較

    貝類毒素的相關(guān)研究多采用HLB柱、C18柱等凈化材料。本研究通過空白海水加標(biāo)方式(0.50 μg/L),分別對比了最優(yōu)條件下自制離子液體鍵合硅膠柱(Silica-[SOIM\][PF6\])和兩種商用化固相萃取柱(HLB柱和C18柱(3 mL,60 mg))的凈化效果和回收率。加標(biāo)海水進(jìn)樣體積均為20 mL。兩種商用固相萃取小柱預(yù)先用5 mL甲醇和5 mL水活化,進(jìn)樣后用2 mL水淋洗、2 mL甲醇洗脫。相應(yīng)條

    件下做6個平行,回收率見表3。結(jié)果表明,自制離子液體鍵合硅膠柱回收效果與商用HLB柱相當(dāng),均優(yōu)于C18柱。自制的離子液體鍵合硅膠柱(Silica-[SOIM\][PF6\])與商用C18柱相比,不僅具有辛基疏水基團(tuán),與目標(biāo)物間還可能存在離子交換作用等多種混合作用力,萃取效果明顯改善。同時,自制小柱填料量(3 mL,50 mg)少于商用HLB柱(3 mL,60 mg),說明其萃取性能與同時具有親脂親水性能的HLB柱相當(dāng)。

    3.6 方法評價

    3.6.1 方法的檢出限及定量限 取0.02~2.50 μg/L的混合貝類毒素海水進(jìn)樣,以色譜峰面積與貝毒混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制校正曲線,3種貝類毒素線性相關(guān)方程分別為: OA, y=-2.96676+2944.44x (R2=0.9969); DTX-2, y=622.875+904.353x (R2=0.9995); DTX-1: y=20.3688+2463.97x (R2=0.9997)。 3種貝毒的檢出限(LOD, S/N>3)為0.01 μg/L,定量限(LOQ, S/N>10)為0.05 μg/L,表明制備的離子液體鍵合硅膠具有較好的萃取效果。

    3.6.2 方法的精密度及萃取材料的重現(xiàn)性 在優(yōu)化條件下,通過貝類毒素加標(biāo)水樣(0.50 μg/L),考察方法的日內(nèi)(n=5)和日間(n=3)精密度。在不同時間,測得3種貝類毒素的RSD在2.8%~12.3%之間,表明此方法精密度較好。對同一批次和不同批次制備材料的萃取效果進(jìn)行重現(xiàn)性評價,同一批次萃取材料(n=5)在同一時間對3種貝類毒素的RSD在 3.8%~9.5%之間,不同批次萃取材料(n=3)在同一時間測得結(jié)果RSD為6.2%~11.6%,說明此萃取材料的制備重現(xiàn)性良好。

    3.7 實(shí)際應(yīng)用

    參照本研究2.2和2.6節(jié)的儀器檢測方法和樣品處理方法,按最優(yōu)的萃取方法對取自青島沙子口的海水樣品進(jìn)行處理,如圖6A所示,海水樣品中不含貝類毒素。為評價方法的富集凈化效果,以此樣品作為空白樣品,添加兩個濃度水平(0.2和1.0 μg/L)的貝類毒素,測定方法的回收率。貝類毒素加標(biāo)海水樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)圖見圖6B,經(jīng)離子液體鍵合硅膠柱處理后,貝類毒素得到了有效富集凈化,根據(jù)公式(1)計算富集倍數(shù)約為40。如表4所示, 3種貝類毒素的加標(biāo)回收率在93.0%~116.0%之間,RSD均小于12%。結(jié)果表明,自制離子液體鍵合硅膠固相萃取材料及相關(guān)前處理方法適用于海水中貝類毒素的萃取檢測。

    4 結(jié) 論

    制備了一種混合模式辛基功能化離子液體共價鍵合硅膠萃取材料,并應(yīng)用于海水中貝類毒素的萃取分析。研究表明, 此固相萃取材料可能通過疏水作用、離子交換作用等多種模式與目標(biāo)貝類毒素(OA、DTX-1和DTX-2)作用,結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜,對海水中3種貝類毒素的檢測顯示了良好的靈敏度和準(zhǔn)確性。優(yōu)化的萃取條件為:進(jìn)樣20 mL海水,用2 mL 50 mmol/L乙酸銨溶液淋洗、3 mL 5 % NH4OH-甲醇洗脫。結(jié)果表明,本方法的萃取效果優(yōu)于商用C18柱,與HLB柱性能相當(dāng),表明本方法是一種測定海水中貝類毒素含量的可行的替代方法。同時,此離子液體功能化硅膠材料具有良好的重現(xiàn)性,可通過淋洗再生,反復(fù)使用,降低了檢測成本。另外,可靈活設(shè)計制備具有多個不同基團(tuán)的離子液體,通過鍵合硅膠作為功能化萃取材料,實(shí)現(xiàn)對環(huán)境和食品不同基質(zhì)中污染物的富集凈化,具有良好的應(yīng)用前景。

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    Abstract Shellfish toxins are a kind of important marine pollutant. In this study, a novel ionic liquid bonded silica gel material (silica-[SOIM\][PF6\]) was prepared by grafting octyl-functionalized ionic liquid onto silica gel, which was characterized and analyzed by infrared spectroscopy (IR), nuclear magnetic resonance (NMR), and elemental analysis. Solid phase extraction cartridge of silica-[SOIM\][PF6\], coupled with LC-MS/MS technique was used to extract and determine the concentration of shellfish toxins [Okadaic acid (OA), Dinophysistoxin-1 (DTX-1) and Dinophysistoxin-2 (DTX-2)\] in seawater for the first time. It was found that the solid phase extraction material silica-[SOIM\][PF6\] had multiple interactions with the 3 kinds of shellfish toxins, such as hydrophobic and ion-exchange. The method was optimized in aspects of volume and pH of the loaded sample solution, as well as the usage of rinsing and eluting reagents. Results indicated that the silica-[SOIM\][PF6\] had good extraction effect on target shellfish toxins in seawater, which was better than or equivalent to the performance of commercial extraction materials. The method had a good linearity (R2>0.995) in the concentration range of shellfish toxins from 0.02 μg/L to 2.50 μg/L, with limit of detection (LOD) of 0.01 μg/L and limit of quantification (LOQ) of 0.05 μg/L. The average recoveries for 3 kinds of shellfish toxins were 93.0%-116.0% at different spiking levels in blank seawater. Simultaneously, the material had good reproducibility, with the relative standard deviation (RSD) of less than 15% intra- and inter-batch. This method was accurate, sensitive, simple and reliable, and could be used for the extraction and detection of shellfish toxins in actual samples.

    Keywords Ionic liquid; Solid phase extraction; Multiple mode; Shellfish toxins; Seawater

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