1種野生多孔菌的分離鑒定及其高產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的篩選

郭 梁，徐偉良，李春冬，魯 鐵，郭元晟，錢(qián)俊平，孫建萍，雅 梅

(1.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000；2.錫林郭勒生物工程研究院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000；3.錫林郭勒食品檢驗(yàn)檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000； 4.河南城建學(xué)院，河南 平頂山 467000)

多孔菌是一類(lèi)子實(shí)層體呈孔狀、質(zhì)地為革質(zhì)至木質(zhì)的大型擔(dān)子菌。多孔菌屬于腐生或者寄生生物，廣泛分布于世界各地。我國(guó)是多孔菌物種多樣性最豐富的國(guó)家，目前已知的多孔菌共計(jì)704種，其中具有藥用價(jià)值的多孔菌多達(dá)60余種[1-3]。我國(guó)對(duì)多孔菌的研究和應(yīng)用歷史悠久，主要集中在傳統(tǒng)的中醫(yī)藥方面[4-5]。多孔菌中，靈芝(Ganodermalucidum)、茯苓(Wolfiporiacocos)、豬苓(Polyporusumbellatus)、樺褐孔菌(Inonotusobliquus)、桑黃(Inonotussanghuang)等都是著名的藥用真菌。多孔菌除了藥用和食用價(jià)值之外，在森林生態(tài)系統(tǒng)的天然更新中也起重要的作用[6-7]。多孔菌在生態(tài)系統(tǒng)中的功能主要依賴(lài)于其分泌的可降解木質(zhì)素的酶類(lèi)，比如漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶。另一方面，多孔菌還是樹(shù)木的病原菌，通過(guò)腐生或者寄生的方式侵染活立木，影響樹(shù)木正常的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至造成樹(shù)木的大面積死亡[8]。因此，對(duì)野生多孔菌的資源調(diào)查和科學(xué)研究具有重要的生態(tài)效益和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。對(duì)野生多孔菌的科學(xué)研究和資源開(kāi)發(fā)離不開(kāi)其菌種制備和種屬鑒定。菌種的分離方法主要有組織分離、孢子分離、基質(zhì)分離3類(lèi)[9]。菌種鑒定、分離及固體和液體培養(yǎng)不僅影響野生多孔菌的人工栽培，而且影響其活性和藥用成分的提取、鑒定及功能分析。

前期對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟境內(nèi)的蕈菌資源調(diào)查中，在錫林郭勒盟正藍(lán)旗采集到1種野生多孔菌，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。隨后對(duì)該菌種進(jìn)行組織分離，利用4種固體培養(yǎng)基、4種液體培養(yǎng)基對(duì)菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)狀態(tài)、生長(zhǎng)速度、菌絲生物量以及漆酶活性等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選最佳固體培養(yǎng)基和高產(chǎn)漆酶的液體培養(yǎng)基，為后續(xù)蕈菌資源的開(kāi)發(fā)提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

EasyTaqPCR Super Mix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，ITS引物由北京睿博興科生物科技有限公司合成，基因組DNA快速抽提試劑盒購(gòu)自上海生物工程股份有限公司，Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0購(gòu)自大連Takara公司。

0.1 mol/L HAc-NaAc(pH值為4.0)緩沖液配制：取22 mL 0.l mol/L的NaAc母液(稱(chēng)量13.61 g NaAc·3H2O，蒸餾水定容至1 L)與78 mL 0.l mol/L的HAc母液(量取5.9 mL濃冰醋酸，蒸餾水定容至1 L)混合；0.5 mmol/L ABTS 溶液配制：0.013 7 g ABTS 溶于少量0.1 mol/L HAc-NaAc緩沖液中，并定容至50 mL。

固體培養(yǎng)基4種，其配方來(lái)自文獻(xiàn)[10-13]。固體培養(yǎng)基A：馬鈴薯切片200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，加水至1 000 mL，自然pH值[10]；固體培養(yǎng)基B(經(jīng)改良)：麥粒100 g(煮汁)、葡萄糖15 g、蛋白胨5 g、瓊脂20 g，加水至1 000 mL，自然pH值[10-11]；固體培養(yǎng)基C：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母浸膏20 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、瓊脂20 g，加水至1 000 mL，自然pH值[12]；固體培養(yǎng)基D(經(jīng)改良)：葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、酵母浸膏10 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、瓊脂20 g，加水至1 000 mL，自然 pH值[13]。

液體培養(yǎng)基4種，其配方來(lái)自文獻(xiàn)[14-16]。1號(hào)培養(yǎng)基：馬鈴薯切片200 g、葡萄糖20 g，加水至1 000 mL，自然pH值[14]；2號(hào)培養(yǎng)基：馬鈴薯切片200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母浸膏2 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，加水至1 000 mL，自然pH值[14]；3號(hào)培養(yǎng)基：葡萄糖30 g、蛋白胨2 g、酵母浸膏5 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.5 g、維生素B1 0.01 g，加水至1 000 mL，自然pH值[15]；4號(hào)培養(yǎng)基：玉米粉30 g、蔗糖10 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，加水至1 000 mL，自然pH值[16]。

1.2 儀器

YC-R50恒溫培養(yǎng)搖床(天津市泰斯特儀器有限公司)、SW-J-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州市博萊爾凈化設(shè)備有限公司)、HWS-250BX恒溫恒濕培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、202-3A電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、Nanodrop 2000c核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)、2720 Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)、MLS-3751L-PC高溫高壓滅菌鍋(日本SANYO公司)、5418R臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)、WD-9413B凝膠成像儀(北京六一生物科技有限公司)、UV9100A紫外分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取 取20 mg干燥多孔菌子實(shí)體，用液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中；加入400 μL Buffer Digestion和4 μL β-巰基乙醇，振蕩混勻，65 ℃水浴1 h；加200 μL Buffer PF，充分顛倒混勻，-20 ℃冰箱放置5 min；室溫10 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中；加入等體積異丙醇顛倒混勻，室溫放置2～3 min，室溫10 000 r/min離心5 min，棄上清；加1 mL 75%乙醇，顛倒漂洗后10 000 r/min離心2 min，棄上清；重復(fù)上一步驟；開(kāi)蓋，室溫倒置5～10 min，至殘留的乙醇完全揮發(fā)；用50 μL ddH2O溶解DNA。利用Nanodrop 2000c核酸蛋白分析儀測(cè)量其濃度，將樣品母液稀釋至300 ng/μL左右，-20 ℃保存。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 以提取的基因組為模板，選用正向引物和反向引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如表1所示。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：模板 1 μL、正向引物和反向引物各 1 μL、EasyTaqPCR Super Mix 10 μL、ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：第1階段，95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性 30 s、69 ℃退火 30 s(每循環(huán)降低退火溫度1 ℃)、72 ℃延伸 1 min，15 個(gè)循環(huán)。第2階段，95 ℃變性 30 s、47 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min，20 個(gè)循環(huán)；73℃加強(qiáng)延伸 1 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 真菌ITS通用引物

1.3.3 序列測(cè)序比對(duì) 將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 進(jìn)行回收。具體步驟：在紫外燈下切出含有目的 DNA 的瓊脂糖凝膠，置于EP管中，向膠塊中加入溶解液 Buffer GM，振蕩混合，放入50 ℃金屬浴中溶解膠塊；將溶解的膠塊溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column，12 000 r/min離心1 min，棄濾液；再將700 μL的Buffer WB加入 Spin Column中，室溫12 000 r/min離心1 min；重復(fù)上述操作1次；將Spin Column安置于新的EP管上，在Spin Column膜的中央加入30 μL滅菌蒸餾水靜置1 min，室溫12 000 r/min離心1 min洗脫DNA。將回收的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京睿博興科生物科技有限公司，用相同引物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接后在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源比對(duì)。

1.3.4 菌種分離與固體培養(yǎng)基的篩選 選取野生多孔菌菌柄與菌蓋的連接處進(jìn)行組織分離培養(yǎng)，分別接種到選定的4種固體培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行初步培養(yǎng)。在長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲的培養(yǎng)皿中，用打孔器取長(zhǎng)勢(shì)相似、大小相同的菌絲塊重新接到新的4種固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，每天測(cè)量記錄菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，至菌絲全部長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿為止，并對(duì)培養(yǎng)的菌絲進(jìn)行分子鑒定。將最終培養(yǎng)的4種固體培養(yǎng)基于電磁爐上煮沸1 min，使瓊脂溶解，取出過(guò)濾(6層無(wú)菌紗布)。將菌絲放入已經(jīng)預(yù)先稱(chēng)量過(guò)的培養(yǎng)皿(質(zhì)量為A0)中，置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中，80 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱(chēng)量皿與菌絲(總質(zhì)量為A1)，計(jì)算菌絲質(zhì)量(A1-A0)。根據(jù)該多孔菌在4種固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度、菌絲干質(zhì)量篩選最優(yōu)固體培養(yǎng)基配方。

1.3.5 菌絲體液體培養(yǎng)基的篩選 將固體培養(yǎng)的菌絲接種于4種選定的液體培養(yǎng)基(100 mL)中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后，測(cè)定其生物量及漆酶活性。培養(yǎng)7 d后，取出過(guò)濾(8層無(wú)菌紗布)，將菌絲放入80 ℃電熱恒溫干燥箱中烘干，測(cè)量菌絲生物量。根據(jù)該多孔菌在4種液體培養(yǎng)基上的生物量、發(fā)酵液中的漆酶活性篩選最優(yōu)液體培養(yǎng)基配方。

1.3.6 菌絲體的漆酶活性測(cè)定 菌絲體的漆酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[17-20]。粗酶液制備：取4種液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)的菌液，用 8 層無(wú)菌紗布過(guò)濾發(fā)酵液，并將濾液25 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清，即為粗酶液。ABTS測(cè)定漆酶活性：設(shè)計(jì)3 mL反應(yīng)體系，含2 700 μL HAc-NaAc、200 μL ABTS、100 μL粗酶液。2 700 μL HAc-NaAc與200 μL ABTS相混，30 ℃ 恒溫水浴 10 min 后，加入 100 μL酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定吸光值的有效范圍為0.1～0.8。測(cè)定吸光值：每隔30 s測(cè)量樣品酶液420 nm下的OD值，共測(cè)量3 min。以100 μL粗酶液沸水浴15 min去除酶活性，作為空白對(duì)照。

酶活性定義：在1 min內(nèi)使l μmol ABTS氧化所需的酶量即為1個(gè)酶活性單位(U)，計(jì)算公式如下：

酶活性(U/L)=N×ΔOD420×106/(36 000×3)

公式中，N為稀釋倍數(shù)，ΔOD420為420 nm下吸光度的變化值，36 000為ABTS氧化態(tài)的摩爾吸光系數(shù)[L/(mol·cm)]。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生多孔菌子實(shí)體的采集和分子鑒定

將采集到的野生多孔菌子實(shí)體(圖1)與分離培養(yǎng)的菌絲體分別利用正向引物和反向引物(表1)，設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(圖2)。由圖2可知，子實(shí)體與菌絲體的3個(gè)平行均在600～700 bp處有ITS序列片段。經(jīng)序列測(cè)序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并利用該菌的ITS序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)存在的序列做同源比對(duì)(圖3)。結(jié)果表明，該菌種與Coriolopsistrogii(KX394807.1)、Trametestrogii(GU166280.1)、Funaliatrogii(EU273516.1)相似性最高，核酸序列的一致性均為100%，即所采集的多孔菌為硬毛粗蓋孔菌。

圖1 野生多孔菌子實(shí)體

圖2 野生多孔菌PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖3 野生多孔菌序列同源比對(duì)

2.2 野生多孔菌菌種的分離和固體培養(yǎng)基的篩選

以4種固體培養(yǎng)基對(duì)該種多孔菌進(jìn)行培養(yǎng)，觀察記錄菌絲在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)，并通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速度和菌絲干質(zhì)量的統(tǒng)計(jì)分析篩選出最適合該種多孔菌生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基配方，結(jié)果見(jiàn)圖4—5及表2。該種多孔菌在固體培養(yǎng)基B上的生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)至第7天時(shí)，皿內(nèi)菌絲已接近全部長(zhǎng)滿(mǎn)，而固體培養(yǎng)基C、D上的菌絲生長(zhǎng)速度略慢，培養(yǎng)至第9天時(shí)才全部長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿表面。從菌絲長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，固體培養(yǎng)基C、D上的菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好，固體培養(yǎng)基A、B上的菌絲長(zhǎng)勢(shì)略差。通過(guò)菌絲干質(zhì)量比較，固體培養(yǎng)基D上培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量最大，為0.132 g，而固體培養(yǎng)基B上培養(yǎng)的菌絲干質(zhì)量最小，為0.033 g，說(shuō)明固體培養(yǎng)基C、D上的菌絲生物量積累較多。綜合以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)，最終確定固體培養(yǎng)基D為該種野生多孔菌的最優(yōu)固體培養(yǎng)基配方。

圖4 野生多孔菌菌絲在4種固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)

圖5 野生多孔菌在4種固體培養(yǎng)基上的菌絲長(zhǎng)度與干質(zhì)量變化

表2 野生多孔菌在4種固體培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)狀況

注：+++表示菌絲粗壯、密，長(zhǎng)勢(shì)良好；++表示菌絲較粗壯、較密，長(zhǎng)勢(shì)較好；+表示菌絲微粗壯、密，長(zhǎng)勢(shì)好。

2.3 野生多孔菌高產(chǎn)漆酶液體培養(yǎng)基的篩選

4種液體培養(yǎng)基上該種多孔菌的生物量(柱狀圖)及漆酶活性(折線(xiàn)圖)見(jiàn)圖6。4號(hào)液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲生物量最大，為10.43 g/L，而1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲生物量分別為4.16、8.56、6.92 g/L，其中1號(hào)液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌絲生物量最小。2號(hào)液體發(fā)酵液中漆酶活性最高，達(dá)907.34 U/L，而1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)液體發(fā)酵液中漆酶活性分別為212.87、60.83、70.18 U/L，其中3號(hào)液體發(fā)酵液中漆酶活性最小。通過(guò)菌絲生物量及液體發(fā)酵液中漆酶活性的比較分析，最終確定2號(hào)液體培養(yǎng)基為該種多孔菌發(fā)酵液產(chǎn)漆酶的最佳培養(yǎng)基配方。

注：柱狀圖為菌絲生物量；折線(xiàn)圖為漆酶活性圖6 野生多孔菌在4種液體培養(yǎng)基中的菌絲生物量及發(fā)酵液中漆酶活性

3 結(jié)論與討論

通過(guò)分子鑒定、固體培養(yǎng)基篩選、高產(chǎn)漆酶的液體培養(yǎng)基篩選，對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟正藍(lán)旗地區(qū)采集的1種野生多孔菌進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，該種野生多孔菌菌株與Coriolopsistrogii(KX394807.1)、Trametestrogii(GU166280.1)、Funaliatrogii(EU273516.1)的ITS一致性為100%，因此，該種野生多孔菌為硬毛粗蓋孔菌。通過(guò)固體培養(yǎng)基的篩選，最終確定固體培養(yǎng)基D(葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、酵母浸膏10 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、瓊脂20 g，加水至1 000 mL,自然pH值)為該種多孔菌的最佳固體培養(yǎng)基配方；以漆酶活性等為指標(biāo)，進(jìn)行液體培養(yǎng)基的篩選，最終確定2號(hào)液體培養(yǎng)基(馬鈴薯切片200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母浸膏2 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，加水至1 000 mL,自然pH值)為該種多孔菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的最佳液體培養(yǎng)基配方，漆酶活性可達(dá)907.34 U/L。錫林郭勒盟除了優(yōu)質(zhì)的草腐蕈菌，還有具高藥用功能及生物開(kāi)發(fā)價(jià)值的木腐多孔菌種質(zhì)資源，硬毛粗蓋孔菌的發(fā)現(xiàn)、鑒定、培養(yǎng)及高產(chǎn)漆酶液體培養(yǎng)基的篩選可為后續(xù)蕈菌資源的開(kāi)發(fā)提供借鑒。同時(shí)，該種硬毛粗蓋孔菌具有菌絲生長(zhǎng)快、漆酶產(chǎn)量高的特點(diǎn)，可以作為高產(chǎn)漆酶的候選工程菌株進(jìn)行后續(xù)研究和開(kāi)發(fā)。