四川麩醋曲藥中酵母菌的分離鑒定及發(fā)酵特性

毛 祥， 夏 玙， 張蕓曌， 朱 敏， 張 曼， 黃 丹， 羅惠波，*

(1.四川理工學院 生物工程學院， 四川 自貢 643000；2.四川省川南曬制麩醋生物釀造技術工程實驗室， 四川 自貢 643000)

四川麩醋是中國四大名醋之一，具有色澤紅棕、醇香回甜、酸味柔和、久陳不腐的特點[1-2]。以麩皮為制醋原料，通過糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等工藝自然開發(fā)式生產(chǎn)，屬于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵[3]。

關于四川麩醋的研究多關注于發(fā)酵過程微生物、風味物質的動態(tài)變化及某一功能菌的篩選[4]。如劉軍等[1]分析了保寧醋固態(tài)發(fā)酵過程中理化指標含量的變化，彭楊等[2]對其固態(tài)發(fā)酵過程中真菌和細菌的多樣性進行分析；于華等[5]從醋醅中篩選出一株產(chǎn)酸能力強的芽孢桿菌，并對其產(chǎn)酸特性進行研究。目前針對四川麩醋發(fā)酵過程中微生物菌群、品質形成機理與調控、風味物質構成及保持等研究較少。

曲藥是麩醋釀造的發(fā)酵啟動劑，能提供豐富的菌系和酶系，為液化、糖化、酒化、發(fā)酵生香提供動力[6]。曲藥微生物經(jīng)過長期馴化，其種類不斷豐富，其中產(chǎn)酯酵母也存在于曲藥中，對醋的風味形成起到重要作用[7]，但有關曲藥中微生物的研究鮮有報道。本研究從四川某麩醋廠提供的曲藥中分離篩選出一株產(chǎn)酯酵母菌，并對其生長特性和發(fā)酵代謝產(chǎn)物進行研究，旨在為提高麩醋的質量和增加其風味提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

麩醋曲藥，四川某麩醋廠；大米、麩皮，市售；牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、瓊脂麥芽糖、可溶性淀粉、糖化酶、中性蛋白酶、乳糖、葡萄糖，均為生化試劑，成都市科龍化工試劑廠；氯化鈉、尿素、KH2PO4、氫氧化鈉、脫氧膽酸鈉、氯仿，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；三丁酸甘油酯，色譜純，四川都康生物科技有限公司。YPD培養(yǎng)基、產(chǎn)酯平板篩選培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基加0.4%三丁酸甘油酯、虎紅瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、無碳源基礎培養(yǎng)基[8]、無氮源基礎培養(yǎng)基[8]；50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

BH200型生物顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；STARTER2C型pH計，福建省泉州市高科杰實驗儀器設備有限公司；250HL型恒溫培養(yǎng)箱，金壇市岸頭中旺實驗儀器廠；YX- 24LDJ型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，河南兄弟儀器設備有限公司；TD- 5Z型臺式低速多管架離心機，北京億達科創(chuàng)科技有限公司；可見分光光度計，上海儀電分析儀器廠；S1000TM型PCR儀，北京博雅創(chuàng)新科技發(fā)展有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；HT300A型自動固相微萃取儀，意大利HTA公司； 7890A- 5975B型氣相色譜- 質譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1發(fā)酵基的配制

大米糖化液的制備：稱取500 g大米粉末于適當?shù)娜萜髦屑尤? 500 mL水，蒸煮20 min后放涼至50 ℃并調節(jié)pH值為4.8～5.4；加入淀粉酶(每克干物質96個酶活力單位)，50 ℃水浴液化30 min，液化完成后調節(jié)pH值為4.0～4.5；加入糖化酶216 U/(g干物質)，60 ℃，糖化35 h后煮沸滅酶，冷卻至室溫后4 000 r/min，離心3 min，收集上清液備用[9-10]。

麩皮浸提液制備：稱取100 g麩皮于適當容器中加入500 mL水，蒸煮10 min后放涼至50 ℃并調節(jié)pH值為4.8～5.4，加入淀粉酶1 500 U/(g干物質)，50 ℃水浴10 min，完成后調節(jié)pH值至中性；加入中性蛋白酶50 000 U/(g干物質)，55 ℃水浴30 min，過濾后取濾液煮沸滅酶，冷卻至室溫后4 000r/min，離心3 min，收集上清液備用[11]。按照大米糖化液與麩皮浸提液之比為7∶3(體積比)，制備發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.2曲藥中酵母菌的分離純化

將曲藥用研缽研磨后稱取10 g至100 mL無菌生理鹽水，150 r/min、28 ℃下振蕩30 min；取1 mL原液，依次進行10倍稀釋，稀釋至10-7倍；對10-5、10-6、10-7稀釋倍數(shù)菌懸液進行平板涂布，涂布于YPD培養(yǎng)基和虎紅瓊脂培養(yǎng)基(在倒平板前應按照每100 mL培養(yǎng)基加入2%的脫氧膽酸鈉溶液2 mL以抑制霉菌菌絲蔓延)，每個稀釋度做3個平行實驗，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h；挑取單菌落，在YPD平板上劃線純化，純菌株移入斜面保藏備用。

1.3.3酵母菌的初步鑒定

觀察并記錄篩選的酵母菌菌落大小、形狀、顏色、透明度、邊緣、質地、濕潤程度等菌落特征；取生理鹽水1滴，滴于載玻片中央，用接種環(huán)挑取菌落少許，涂勻，加蓋玻片，于40倍顯微鏡鏡下觀察細胞形態(tài)；觀察記錄菌體形狀、大小、出芽情況、芽體形態(tài)、是否有裂殖現(xiàn)象等。

1.3.4酵母菌的18S rDNA分子鑒定

提取酵母菌總DNA[12]，進行18S rDNA的PCR擴增，通用引物NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL- 4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3′)。PCR反應體系(50 uL)為：無菌超純水33.5 μL，Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Mg2+3 μL，兩個引物各1 μL(10 mol/L)，模板2 μL，Taq聚合酶0.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min；通過140 V電泳20 min檢測結果。將測得的序列在GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，并將獲得的同源序列和測定序列在Clustalx軟件包中進行分析，形成一個多重序列匹配排列陣。通過MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5酵母菌生長特性實驗

探究不同濃度的pH值、碳源、氮源、酒精度的發(fā)酵條件對酵母菌生長的影響。將發(fā)酵培養(yǎng)基pH值分別調節(jié)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，以5%接種量接入目的菌株，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，測定不同pH值下的發(fā)酵液OD600值；以淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖為碳源，分別加入無碳源基礎培養(yǎng)基中，以5%接種量接入目的菌株，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，測定不同碳源的發(fā)酵液OD600值；以尿素、酵母膏、蛋白胨、硫酸銨作為氮源，分別加入無氮源基礎培養(yǎng)基中，以5%接種量接入目的菌株，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，測定不同氮源的發(fā)酵液OD600值。在滅菌后的YPD液體培養(yǎng)基中，將酒精濃度分別調節(jié)為0%、2%、4%、6%、8%、10%，以5%接種量接入目的菌株，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，測定不同酒精濃度的發(fā)酵液OD600值。

圖1 初篩平板產(chǎn)酯透明圈圖Fig.1 Transparent zone of ester production of initial screening plate

1.3.6發(fā)酵代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性成分的定量測定

樣品前處理：吸取6 mL空白液和發(fā)酵液放入15 mL的頂空瓶中，加入1.5 g氯化鈉，20 μL標品；在60 ℃萃取40 min，并230 ℃解吸3 min。GC-MS條件參數(shù)：色譜條件為DB-FFAP彈性石英毛細管柱，柱長30 mm，內徑0.25 mm，液膜厚度0.25 μm，載氣為氦氣，流量1.0 mL/min，不分流，進樣口溫度230 ℃；柱溫為起始溫度35 ℃，以5 ℃/min 的速度升至180 ℃，再以10 ℃/min 的速度升至230 ℃，保持5 min。質譜條件為電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電離方式EI，質量掃描范圍20～500 amu，溶劑延遲3 min。數(shù)據(jù)分析：檢出揮發(fā)性物質的質譜圖，通過與標準譜庫(NIST05a.L)對比鑒定，匹配度和純度大于800作為鑒定結果[13]。以乙酸丁酯為內標，按峰面積歸一化法算出樣品中各組分的相對含量[14]。

2 結果與討論

2.1 酵母菌的分離純化及篩選結果

通過稀釋涂布和平板劃線，從曲藥中分離出10株酵母菌，分別編號Y1至Y10。Y1、Y2、Y3、Y8、Y10為第一類：菌落為乳白色、較濕潤、邊緣整齊、表面干燥、隆起圓整；Y4、Y5、Y7、Y9為第一類：菌落為白色、濕潤、邊緣整齊，表面光滑，隆起圓整；第三類是Y6，菌落為乳白色、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、隆起圓整。形態(tài)特征的分類：第一類呈橢圓狀，第二類呈橢圓狀，第三類呈圓形；三類酵母菌均為芽殖。

將Y1至Y10酵母菌株點種到產(chǎn)酯平板篩選培養(yǎng)基上得到圖1，測量并計算透明圈直徑D和菌落直徑d之比得到表1。從表1中可看出菌株Y1的D/d最大，故選擇Y1作為后續(xù)實驗菌株。

表1 酵母菌株Y1-Y10產(chǎn)酯透明圈結果

2.2 目的菌株的18S rDNA分子鑒定結果

對酵母菌株Y1提取總DNA，并進行18S rDNA的PCR擴增，得到的擴增電泳結果如圖2。由圖2可以看出，PCR電泳圖條帶單一，清晰且明亮，無拖尾、無彌散現(xiàn)象、無二聚體條帶；擴增出來的18S rDNA條帶大小為750～1 000 bp，與目標長度一致，可以將PCR產(chǎn)物被送至測序公司測序。將測序結果在NCBI上進行Blast比對，獲得同源性高的序列，并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖3。鑒定酵母菌Y1為異常威克漢姆酵母菌亞種，命名為Wicherhamomycessp.Lzcq 2014。

圖2 酵母Y1 18S rDNA PCR擴增電泳圖Fig.2 Amplified electrophoretic profile of 18S rDNA regions of yeast Y1

圖3 酵母菌Y1的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeast Y1

2.3 分離菌株的生長特性分析

圖4 不同pH、酒精濃度、碳源、氮源對Wicherhamomyces sp. Lzcq 2014生長量的影響Fig.4 Effects of different pH values, alcohol concentrations, carbon sources, and nitrogen sources on mass growth of Lzcq 2014

不同初始pH值、酒精濃度、碳源、氮源下培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液酵母生長情況如圖4。通常，微生物在pH值為3.0～9.0的環(huán)境中正常生長，超出這個范圍則容易死亡。當微生物處于強酸環(huán)境中，因細胞膜的質子“泵”失去平衡而不能調節(jié)體內外的質子濃度差，從而導致細胞死亡。實驗結果表明，酵母菌Wicherhamomycessp.Lzcq 2014菌株的最適生長pH值為5.0～5.5，其適合在偏弱酸性的環(huán)境生長。目前，酵母的酒精耐受機理還未完全清楚，溫度和滲透壓等因素均與酵母的酒精耐性有關[15]。Wicherhamomycessp.Lzcq 2014菌株在發(fā)酵代謝的時候，會產(chǎn)生酒精。產(chǎn)酯酵母對乙醇的親和力較好，當有一定濃度乙醇存在時，更有利于酯類物質的產(chǎn)生。實驗結果表明，Wicherhamomycessp. Lzcq 2014菌株的生長量隨著酒精度的增大而變小，呈一定的反相關關系，且在酒精度為10%時，生長量幾乎為零，說明該酵母不適宜在有一定酒精濃度的環(huán)境中生長。酵母的生長繁殖需要一定的碳源和氮源，不同碳源、氮源的分子結構不一樣，微生物對其利用生長狀況也會不一樣。劉曉明等[16]研究了酵母對不同碳源(玉米粉、麩皮、豆面、葡萄糖)的利用效果，結果表明玉米粉對酵母發(fā)酵為較佳碳源。本實驗結果表明，Wicherhamomycessp. Lzcq 2014對不同單一碳源的同化能力的強弱。順序依次是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉，Wicherhamomycessp. Lzcq 2014對不同氮源的同化能力的強弱順序依次是酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素。

2.4 分離菌株發(fā)酵代謝的揮發(fā)性成分分析

采用HS-SPME-GC-MS技術，對空白培養(yǎng)基和Wicherhamomycessp. Lzcq 2014發(fā)酵液的揮發(fā)性成分進行檢測，結果見表2、表3。由表2、表3可以看出，發(fā)酵液中主要的成分是乙酸乙酯、甲酸異戊酯、丙酸苯乙酯和苯乙醇等，且乙酸乙酯濃度遠高于其他化合物，其質量濃度為0.641 mg/L，說明這是一株高產(chǎn)乙酸乙酯的酵母菌株；其他化合物的含量相對較少。丙酸苯乙酯的含量變化可能是由于酵母菌在生長過程中分解了部分丙酸苯乙酯。2,4-二叔丁基苯酚和環(huán)己醇在發(fā)酵液中未檢出，說明已被分解或轉化成其他化合物。只在發(fā)酵液中檢出甲酸異戊酯，說明此化合物是新生成的。

表2 空白培養(yǎng)基揮發(fā)性成分

表3 酵母Y1發(fā)酵代謝揮發(fā)性成分

3 結 論

本實驗從麩醋曲藥中分離出10株酵母菌，分別編號為Y1至Y10，通過產(chǎn)酯平板篩選培養(yǎng)基得出Y1為這10株菌中產(chǎn)酯最好的一株，因此將Y1作為實驗菌株。通過18S rDNA分子鑒定和構建酵母菌Y1的系統(tǒng)發(fā)育進化樹確定酵母菌Y1為異常威克漢姆酵母菌亞種(命名為Wicherhamomycessp.Lzcq 2014)。Wicherhamomycessp. Lzcq2014的最適合生長pH值在5.0～5.5，其耐酒精的能力相對較弱，在酒精度為10%的情況下幾乎不再生長；對不同碳源的同化能力的強弱順序依次是葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉；對不同氮源的同化能力的強弱順序依次是酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素。通過HS-SPME-GC-MS技術分析發(fā)酵液的揮發(fā)性風味成分，得出發(fā)酵液中主要成分是乙酸乙酯，其質量濃度為0.640 79 mg/L，遠高于其他代謝產(chǎn)物。其他代謝產(chǎn)物分別為甲酸異戊酯、丙酸苯乙酯、苯乙醇，質量濃度分別為0.041 36、0.039 43、0.023 00 mg/L。