非洲菊4個(gè)POD基因的克隆及表達(dá)分析

郝向陽(yáng)，孫雪麗，劉 范，項(xiàng)蕾蕾，王天池，賴鐘雄，程春振

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，園藝學(xué)院，福州 350002)

過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD，EC 1.11.1.X)是一類普遍存在于動(dòng)植物和微生物中的氧化酶。植物中存在Class Ⅰ和Ⅲ兩類POD，其中Class Ⅲ POD(PRX，EC 1.11.1.7)為植物所特有[1-2]。PRX由一個(gè)多基因家族編碼，在擬南芥中該基因家族有73個(gè)成員，而水稻有138個(gè)成員[3-5]。此類POD參與植物體內(nèi)的過(guò)氧自由基和H2O2平衡的維持[6-7]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。此外，POD還參與木質(zhì)素合成[9-10]、活性氧代謝[11]、激素調(diào)控[12]及其他脅迫應(yīng)答[13-16]。如：在低溫和干旱脅迫下，煙草POD活性均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)[17]，說(shuō)明POD參與了煙草低溫和干旱脅迫的響應(yīng)；李國(guó)旗等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，楊樹(shù)形成層POD活性除了與耐鹽性有關(guān)外還與其所處的生長(zhǎng)周期有關(guān)。

植物被病原菌侵染后，能迅速產(chǎn)生大量的ROS來(lái)抵御病原菌的入侵或殺死病原菌，但過(guò)量的ROS會(huì)損害細(xì)胞甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。POD能夠清除植物體內(nèi)活性氧，在植物抗病過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用[19-20]。蘇亞春等[21]的研究表明甘蔗ScPOD02基因在抗病品種中受黑穗病菌誘導(dǎo)顯著，在中感及感病品種中不變或略微下調(diào)表達(dá)。Zhang等[22]在玉米上也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象：在黑穗病菌侵染后，抗病品種中POD基因上調(diào)表達(dá)，而在感病品種中下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明POD基因的表達(dá)水平與植物抗病性相關(guān)。

鑒于POD在植物抗逆防御反應(yīng)中的重要作用，科學(xué)家們對(duì)POD基因及其編碼的蛋白展開(kāi)了大量研究。非洲菊(GerberajamesoniiBolus)是世界五大鮮切花之一，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[23]。目前有關(guān)非洲菊POD基因及其編碼蛋白的研究較少。本研究中，從實(shí)驗(yàn)室前期獲得的非洲菊轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得4條包含完整ORF的POD基因序列，對(duì)它們進(jìn)行了克隆及生物信息分析，同時(shí)還研究了不同脅迫處理下這些基因和POD活性的變化特征，為揭示非洲菊POD基因的功能以及今后它們?cè)诜侵蘧湛剐杂N中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗(yàn)用非洲菊‘玲瓏’植株由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所和三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

(1)器官取樣：取非洲菊根、葉柄和葉片，備用。

(2)水楊酸處理：用100 μmol/L水楊酸(SA)噴灑非洲菊葉片至葉片滴水，并于處理后0、4、8 、12和24 h取葉片。

(3)PEG處理：用30%聚乙二醇(PEG)溶液一次性澆透土壤，并于處理后0、1、2 、3和6 h取葉片。

(4)低溫處理：將非洲菊植株置于4 ℃光照培養(yǎng)箱中，分別于處理后0、4、8和12 h取葉片。

(5)根腐病菌接種：從28 ℃暗培養(yǎng)5 d的隱地疫霉菌落邊緣挑取直徑為0.5 mm菌塊置于100 mL PDB培養(yǎng)基中，28 ℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，稀釋3倍后備用。將非洲菊根部輕輕劃傷后置于隱地疫霉菌液中2 h，移栽，并于處理后0、2 、4 和6 d取根系。

所有樣品取樣后立即置于液氮中速凍，之后置于-80 ℃超低溫冰箱中，用于后續(xù)RNA提取及POD活性測(cè)定。

1.2 方 法

1.2.1酶活測(cè)定POD催化H2O2氧化特定底物，其產(chǎn)物在470 nm有特征光吸收，采用分光光度法，利用植物過(guò)氧化物酶試劑盒(購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測(cè)定不同處理樣品中POD活性。

1.2.2RNA提取及cDNA合成利用Trizol RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取非洲菊總RNA。采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈用于POD基因cDNA的克隆。同時(shí)采用 TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal)試劑盒(全式金)逆轉(zhuǎn)錄合成不同處理樣品的cDNA用于qRT-PCR試驗(yàn)。所有步驟均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3POD基因克隆及測(cè)序驗(yàn)證PCR 反應(yīng)體系(25 μL)：Dream TaqTMGreen PCR Master Mix (2×) 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL。所用引物序列見(jiàn)表1。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。采用Gel/PCR Extraction Kit回收目的片段，連接pMD 18-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，經(jīng)菌液PCR鑒定后選取陽(yáng)性克隆子送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4POD基因及蛋白生物信息學(xué)分析采用在線軟件對(duì)POD基因及其編碼蛋白進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析(ExPASy，http://web.expasy.org/ protparam/)、信號(hào)肽鑒定(SignalP 4.1 Server，http://www.cbs. dtu.dk/ services/SignalP/)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)(CELLO:S，http://cello.life.nctu.edu.tw/)、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(TMpred，http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED _form.html)、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)(NetPhos 3.1 Server，http://www.cbs.dtu. dk/services/NetPhos/)、保守結(jié)構(gòu)域分析(NCBI Conserved Domain Search，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi)、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(PSIPRED，http://bioinf.cs.ucl.ac. uk/psipred/)。從TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中下載擬南芥POD蛋白序列，采用MEGA5.2.2鄰近歸并法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5非洲菊POD基因表達(dá)分析以非洲菊18SrRNA為內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。將不同cDNA樣品等體積混樣，隨后按1、0.2、0.04、0.08、0.001 6倍進(jìn)行梯度稀釋用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以稀釋50倍的cDNA為模板，采用Roche Lightcycler 480熒光定量PCR儀進(jìn)行相對(duì)表達(dá)分析。qRT-PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。qRT-PCR反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)熒光染料 10 μL，ddH2O 7.4 μL，上下游引物各0.8 μL，模板1 μL。試驗(yàn)所用引物序列及相關(guān)信息見(jiàn)表1。采用Excel2003和SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 POD基因克隆及序列分析

在非洲菊轉(zhuǎn)錄組中查找獲得4條具有完整ORF的POD基因序列，使用特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了1 000～1 200 bp PCR產(chǎn)物(圖1)。NCBI Blastn比對(duì)發(fā)現(xiàn)：4個(gè)非洲菊POD基因分別與萵苣(Lactucasativa)POD4、向日葵(Helianthusannuus)POD5、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)POD7、向日葵POD42相似度最高，相似度分別為79%、76%、73%和88%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果將它們分別命名為GjPOD4、GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42，GenBank登錄號(hào)分別為MH708528、MH708531、MH708529和MH708530。它們的CDS分別為975 、966 、966 和1 005 bp，預(yù)測(cè)可分別編碼324、321、321和334個(gè)氨基酸。4個(gè)GjPOD基因起始密碼子均為ATG，GjPOD42和GjPOD5終止密碼子為TAA，GjPOD7和GjPOD4的終止密碼子為TGA。

M.DL2000；1～4分別代表GjPOD5、GjPOD4、GjPOD42和GjPOD7圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖M.DL2000； 1-4 represent GjPOD5, GjPOD4, GjPOD42 and GjPOD7, respectivelyFig.1 Electrophoresis result of PCR products

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1GjPOD蛋白基本理化性質(zhì)分析結(jié)果蛋白理化性質(zhì)分析顯示，4個(gè)非洲菊POD蛋白均屬于不穩(wěn)定堿性蛋白，除GjPOD5外，均為親水蛋白(表2)。GjPOD4中絲氨酸(Ser)含量最高，達(dá)12%，其次是丙氨酸(Ala)為9.9%；GjPOD5中亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)含量最高，均為11.2%，其次是絲氨酸(Ser)9.3%；GjPOD7絲氨酸(Ser)含量高達(dá)12.8%，其次是丙氨酸(Ala)，為9.3%；而GjPOD42中亮氨酸含量最高，達(dá)10.5%，其次是絲氨酸(Ser)，為7.2%。

2.2.2亞細(xì)胞定位及保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示GjPOD4主要定位于葉綠體和胞外區(qū)，GjPOD5定位于液泡，GjPOD7主要定位于胞外區(qū)，GjPOD42主要定位細(xì)胞質(zhì)。

保守結(jié)構(gòu)域和結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，POD蛋白均含有完整的保守結(jié)構(gòu)域(圖2)，含有血紅結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)和鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，屬于植物亞鐵紅素依賴Ⅲ型過(guò)氧化物酶超家族成員。Motif預(yù)測(cè)結(jié)果顯示4個(gè)GjPOD含有5個(gè)相同的Motif(圖3)。

2.2.3信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域磷酸化修飾位點(diǎn)分析結(jié)果經(jīng)信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)4個(gè)POD在N端的1～26個(gè)氨基酸內(nèi)含有信號(hào)肽。TMpred分析發(fā)現(xiàn)POD均含有由內(nèi)向外和由外向內(nèi)的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。磷酸化修飾位點(diǎn)分析結(jié)果顯示：GjPOD7含有磷酸化位點(diǎn)數(shù)最多，為40個(gè)，其次是GjPOD4和GjPOD42，分別為36和35個(gè)，而GjPOD5磷酸化位點(diǎn)最少，為22個(gè)(表3)。

2.2.4GjPOD蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果通過(guò)預(yù)測(cè)POD二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)4個(gè)POD蛋白含有較多的α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲。GjPOD4含有38.89%的α-螺旋和41.61%無(wú)規(guī)則卷曲，僅含有4.63%的β-折疊，其余14.81%為延伸片段；GjPOD5的α-螺旋的含量最高，為41.12%，無(wú)規(guī)則卷曲為38.32%，β-折疊和延伸片段分別為4.98%和15.58%；GjPOD7的α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、β-折疊和延伸片段分別為38.32%、40.19%、5.30%和16.2%；GjPOD42的α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸片段和β-折疊分別為40.42%、38.32%、15.2%和5.99%。

表2 4個(gè)GjPOD蛋白基本理化性質(zhì)分析結(jié)果

下劃線和紅框分別表示保守結(jié)構(gòu)域和血紅素結(jié)合位點(diǎn)圖2 多重氨基酸序列比對(duì)The underlined characters and the characters in the red box represent the secretory peroxidase conserved domain and heme binding site of POD, respectivelyFig.2 Multiple alignment of the amino acid sequences

圖3 POD保守結(jié)構(gòu)域和motif分析Fig.3 Aanlysis result of the identified conserved domains and motifs in POD proteins

蛋白Protein長(zhǎng)度Length/aa信號(hào)肽Signal site跨膜結(jié)構(gòu)域Transmembrane domain磷酸化修飾位點(diǎn)Phosphorylation site內(nèi)→外Inside→Outside外→內(nèi)Outside→InsideSTYGjPOD43241～26232862GjPOD53211～21421471GjPOD73211～242124124GjPOD423341～213319124

2.2.5聚類分析結(jié)果系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明：發(fā)現(xiàn)除AtPRX12和19外，大致分為5組，與擬南芥POD基因家族進(jìn)化樹(shù)結(jié)果類似[3](圖4)。非洲菊4條POD并未聚在一起，GjPOD4和GjPOD7與擬南芥AtPRX52聚為一類，GjPOD5與擬南芥AtPRX47聚為一類，屬于Group4，GjPOD42與擬南芥AtPRX42聚為一類，屬于Group1(圖4)。

2.3 不同器官及不同處理下POD活性及POD基因表達(dá)差異

2.3.1不同器官中POD活性及POD基因表達(dá)差異通過(guò)測(cè)定不同器官中POD活性發(fā)現(xiàn)：非洲菊葉片中POD活性最高，根和葉柄中活性相差不大(圖5，A)，但未達(dá)到顯著水平。

基因表達(dá)分析結(jié)果(圖5，B)顯示：GjPOD4在根和葉柄中的表達(dá)量極顯著低于葉片(P< 0.01)，分別約為葉片的50%和10%；GjPOD5在根中的表達(dá)量顯著高于葉片(P< 0.05)；GjPOD7在根中的表達(dá)量最高，其次是葉片，葉柄最低；GjPOD42在根中和葉柄中的表達(dá)量極顯著低于葉片(P< 0.01)，僅約為葉片的10%。

At. 擬南芥；Gj. 非洲菊；紅色代表GjPODs；Group1～Group5表示5組主要的PODs圖4 POD系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)At. Arabidopsis thaliana, Gj. Gerbera jamesonii Bolus; Characters in red present represent the gjPODs; Group1-Group5 represent the five major POD groupsFig.4 Phylogenetic tree of PODs

*和**分別表示0.05和0.01水平顯著性差異，下同.圖5 不同組織器官中POD活性(A)以及基因表達(dá)(B)* and ** indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 levels, respectively. The same as belowFig.5 The POD activities(A) and POD expression patterns(B) in different organs of gerbera

相關(guān)性分析結(jié)果(表4)顯示：在不同器官中GjPOD42基因的表達(dá)與POD活性呈顯著正相關(guān)(P< 0.05)，GjPOD4基因的表達(dá)與POD活性有一定的正相關(guān)性，但未達(dá)到顯著水平；GjPOD5和GjPOD7的表達(dá)與POD活性呈負(fù)相關(guān)，但也未達(dá)到顯著水平(表4)。

2.3.2非生物脅迫下POD活性及POD基因表達(dá)差異在SA處理過(guò)程中，POD活性呈現(xiàn)出“升-降-升”的變化趨勢(shì)，在4 h時(shí)活性最高，約為對(duì)照的2.5倍(圖6，A)。4個(gè)基因的表達(dá)也均呈現(xiàn)“先升后降”的變化趨勢(shì)(圖6，B)，其中GjPOD4變化最明顯，在4 h時(shí)表達(dá)量迅速升高，為對(duì)照組的30倍，8 h表達(dá)量為對(duì)照的23倍，之后雖有所下降但仍高于對(duì)照。GjPOD5表達(dá)量在SA處理4 h后極顯著低于對(duì)照。GjPOD7與GjPOD42的表達(dá)水平在SA處理8 h達(dá)到最高，約為對(duì)照組的2倍，之后則極顯著低于對(duì)照。相關(guān)性分析結(jié)果(表4)表明：在SA處理下，4個(gè)GjPOD基因表達(dá)水平與POD活性間不存在顯著相關(guān)性，而GjPOD7與GjPOD42的表達(dá)水平間存在極顯著正相關(guān)(P< 0.01)。

使用PEG處理模擬干旱脅迫，結(jié)果顯示：在PEG處理?xiàng)l件下，POD活性呈現(xiàn)出“先升后降”的變化趨勢(shì)，且均高于對(duì)照，并在3 h達(dá)到峰值，約為對(duì)照的2倍(圖6，A)。GjPOD4基因的表達(dá)在1 h變化不大，在2 和6 h顯著上調(diào)(約為對(duì)照的3倍)；GjPOD5基因的表達(dá)量在PEG處理早期(1 h)和6 h時(shí)極顯著低于對(duì)照，而在2和3 h極顯著高于對(duì)照；GjPOD7與GjPOD42的表達(dá)量在3 h時(shí)極顯著高于對(duì)照(圖6，D)。相關(guān)性分析結(jié)果(表4)顯示：在PEG處理?xiàng)l件下，POD基因的表達(dá)與活性無(wú)顯著相關(guān)性，而GjPOD7與GjPOD42的表達(dá)水平間存在極顯著正相關(guān)(P< 0.01)，GjPOD4與GjPOD7、GjPOD4與GjPOD42的表達(dá)水平間存在一定負(fù)相關(guān)性。

表4 POD活性與POD表達(dá)水平相關(guān)性分析

注：* 表示在0.05水平上(雙側(cè))顯著相關(guān)，**表示在0.01水平上顯著相關(guān)

Note: * indicates significant correlation at the 0.05 level (bilateral), ** indicate significant correlation at the 0.01 level

A.不同處理；B.水楊酸處理；C.低溫(4 ℃)脅迫；D.PEG干旱處理；E.病原菌處理圖6 不同處理下POD活性(A)及其GjPOD基因(B～E)表達(dá)情況A. The different treatments；B. SA treatment；C. Cold(4 ℃)stress；D. PEG treatments；E. Pathogen treatmentFig.6 The POD activities (A) and GjPOD gene expression patterns (B-E) under different treatments

在4 ℃低溫處理下，非洲菊葉片POD活性呈“升-降-升”的變化趨勢(shì)，且均高于對(duì)照，在12 h時(shí)活性達(dá)到最高，為對(duì)照組的3倍(圖6，A)。GjPOD4基因的表達(dá)呈現(xiàn)“升-降-升”的變化趨勢(shì)，在低溫處理8 h時(shí)顯著低于對(duì)照；而低溫處理卻極顯著抑制GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42基因的表達(dá)，在12 h時(shí)的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照分別下降了2倍、11倍和11倍，但GjPOD5在12 h上調(diào)表達(dá)(圖6，C)。相關(guān)性分析結(jié)果(表4)表明：POD基因的表達(dá)與POD活性間不存在顯著相關(guān)性，而GjPOD5與GjPOD7、GjPOD5與GjPOD42的表達(dá)水平間存在顯著正相關(guān)(P< 0.05)，GjPOD7與GjPOD42的表達(dá)水平間存在極顯著正相關(guān)(P< 0.01)。

2.3.3隱地疫霉處理對(duì)非洲菊POD活性及POD基因表達(dá)的影響接種隱地疫霉2 d后，非洲菊植株葉片出現(xiàn)輕微失水的現(xiàn)象，而此時(shí)根系中POD活性迅速升高，約為對(duì)照的2倍，之后活性開(kāi)始下降但仍高于對(duì)照(圖6，A)。GjPOD4、GjPOD7和GjPOD42的表達(dá)在響應(yīng)根腐病的過(guò)程中均呈現(xiàn)“先升后降”的變化趨勢(shì)，在4 d時(shí)表達(dá)量最高，分別約為對(duì)照的3倍、3倍和4倍，為2 d時(shí)的1.84倍、1.06 倍和1.2倍；而GjPOD5則呈現(xiàn)出“升-降-升”的變化趨勢(shì)，2 d時(shí)的表達(dá)量最高，約為對(duì)照組的2倍，且存在極顯著差異(P< 0.01)，4 d時(shí)的表達(dá)量低于對(duì)照組，6 d時(shí)的表達(dá)量略高于對(duì)照組(圖6，E)。相關(guān)性分析結(jié)果(表4)表明：在隱地疫霉處理?xiàng)l件下，4個(gè)基因的表達(dá)與活性雖未達(dá)到顯著水平，但均呈一定的正相關(guān)性，而GjPOD7與GjPOD42的表達(dá)水平間存在顯著正相關(guān)(P< 0.05)，GjPOD4與GjPOD5的表達(dá)水平間存在一定的負(fù)相關(guān)。

3 討 論

POD是植物抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一。本研究基于非洲菊轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，篩選獲得4個(gè)具有完整CDS的POD基因(GjPOD4、GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42)，并利用RT-PCR技術(shù)從‘玲瓏’非洲菊中克隆獲得這些基因cDNA序列。蛋白序列分析結(jié)果表明這4個(gè)POD基因所編碼的蛋白均屬于植物亞鐵紅素依賴Ⅲ型過(guò)氧化物酶超家族成員。通過(guò)對(duì)這些基因進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)分析，同時(shí)結(jié)合POD活性，發(fā)現(xiàn)GjPOD廣泛參與非洲菊抗逆防御反應(yīng)，此外本研究還發(fā)現(xiàn)這4個(gè)GjPOD基因存在一定的功能冗余但也有所差異。

3.1 GjPOD基因廣泛參與非洲菊抗逆防御反應(yīng)

Class Ⅲ POD為植物所特有，包含多種同工酶和基因結(jié)構(gòu)，其功能多樣性，能夠廣泛參與植物體內(nèi)多種代謝活動(dòng)。

POD基因不僅可以被植物激素調(diào)節(jié)，也可以被干旱等多種非生物脅迫調(diào)節(jié)，在植物抗逆防御反應(yīng)過(guò)程中也同樣發(fā)揮著重要作用[5, 24-25]。過(guò)表達(dá)APX基因可以增加紅藻的耐熱性、提高低溫下煙草種子的萌發(fā)率、增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草的耐寒性、提高水稻孕穗期的耐寒性和結(jié)實(shí)率[26-28]。本研究中的研究發(fā)現(xiàn)在低溫、干旱(PEG模擬)條件下GjPOD基因均會(huì)出現(xiàn)差異表達(dá)，暗示它們?cè)诜侵蘧盏钟巧锩{迫反應(yīng)中發(fā)揮著作用。

POD在植物抗病過(guò)程中的重要作用已在多個(gè)物種中得到驗(yàn)證[21-22, 25, 29-30]。Hilaier等[29]發(fā)現(xiàn)水稻葉片感染白葉枯病菌后OsPRX114上調(diào)表達(dá)；Choi等[25]發(fā)現(xiàn)辣椒在響應(yīng)病原菌入侵的過(guò)程中，CaP02基因能夠參與調(diào)控H2O2水平，并且H2O2水平與編碼病原相關(guān)蛋白基因的表達(dá)密切相關(guān)。本研究中，GjPOD4、GjPOD7和GjPOD42的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均受根腐病菌侵染誘導(dǎo)顯著，而GjPOD5在感病初期(2 d)也極顯著上調(diào)，說(shuō)明它們?cè)诜侵蘧枕憫?yīng)根腐病菌入侵的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

3.2 GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42間可能存在一定的功能冗余

通過(guò)分析非洲菊4條POD基因編碼蛋白序列，發(fā)現(xiàn)它們擁有相同的保守結(jié)構(gòu)域和motif，暗示它們的功能和作用方式可能比較相似。基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，這些基因尤其是GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42在不同處理下的變化趨勢(shì)大致相同。此外，相關(guān)性分析結(jié)果也表明它們的表達(dá)水平在各種處理下多存在顯著或極顯著正相關(guān)，說(shuō)明它們之間可能存在功能冗余。

3.3 GjPOD4可能具有不同的功能

植物中存在不同的POD亞型，定位在細(xì)胞質(zhì)、過(guò)氧化物酶體、線粒體和葉綠體等不同的細(xì)胞器中，亞細(xì)胞定位不同可能與其功能有關(guān)。本研究亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示GjPOD4主要定位于葉綠體和胞外區(qū)，暗示其可能為胞外分泌/細(xì)胞壁類型的PRX家族成員，參與細(xì)胞壁的新陳代謝，如木質(zhì)素的聚合反應(yīng)[30]。GjPOD4基因的表達(dá)趨勢(shì)除在隱地疫霉處理下與GjPOD7和GjPOD42相近外，在其他處理?xiàng)l件下與其他3個(gè)GjPOD差異極大。在SA處理早期的GjPOD4受誘導(dǎo)程度也顯著高于其他GjPOD，推測(cè)其可能參與植物系統(tǒng)獲得性抗性[17]。以上結(jié)果表明GjPOD4的功能可能與其他GjPOD有所差異。