鹽酸副玫瑰苯胺法測定當(dāng)歸藥材中二氧化硫殘留量的不確定度評定＊

劉玲 ，陶松 ，劉立民 ，張夢穎 ，張五萍 ，林婷婷

(1、江西省人民醫(yī)院藥學(xué)部，南昌 330006；2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南昌 330006)

當(dāng)歸是我國常用中藥材之一，具有補血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤腸通便。用于血虛微黃，眩暈心悸，月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，虛寒腹痛，風(fēng)濕痹痛，跌撲損傷，癰疽瘡瘍，腸燥便秘[1]。一些不法商人在加工當(dāng)歸的過程中，用硫磺薰蒸以防蟲防霉，導(dǎo)致當(dāng)歸飲片中殘留有二氧化硫。過量的二氧化硫殘余，使服用者易產(chǎn)生惡心、嘔吐等胃腸道反應(yīng)及眼、鼻粘膜刺激癥狀，嚴重時易產(chǎn)生喉頭痙攣水腫等[2]，因此測定當(dāng)歸中二氧化硫含量具有重要意義。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)系的參數(shù)。不確定度可以是標(biāo)準(zhǔn)偏差或其倍數(shù)，或是說明了置信水平區(qū)間的半寬度[3]。由于測量不確定度是對測量結(jié)果的定量表征，中國合格評定認可委員會（CNAL）在對實驗室進行認可時，都要求開展測量不確定的評定[4]。本文采用鹽酸副玫瑰苯胺法測定當(dāng)歸藥材中二氧化硫殘留量，根據(jù)國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的計量技術(shù)規(guī)范 《測量不確定度評定與表示》（JF1059-1999）中有關(guān)規(guī)定，對鹽酸副玫瑰苯胺法測定當(dāng)歸藥材中二氧化硫殘留量過程進行分析，量化了各不確定度分量，并提出了該法的合成不確定度。通過評定與分析，以減少檢測過程中的誤差，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 原理

測量不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，它合理地賦予被測值的分散性。該分散性主要涉及到A類不確定度、B類不確定度和合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度[5]。⑴A類不確定度：由一系列測量結(jié)果統(tǒng)計分布計算，用試驗標(biāo)準(zhǔn)偏差表征，一般由貝塞爾公式法s=計算得。⑵B類不確定度：基于經(jīng)驗或其它信息的概率分布估計出來，用標(biāo)準(zhǔn)偏差表征。⑶合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：將A類不確定度、B類不確定度的平方和開方的方法疊加起來給出合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。 由此公式 uc[y （x1，x2…）]=計算得合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。測量不確定度評估過程包括如下步驟：步驟1.詳細說明被測量；步驟2.識別不確定度來源；步驟3.量化不確定度；步驟4.計算合成不確定度。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器與材料 UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；AUW220D型電子分析天平（日本島津公司）；HHS型電熱鼓風(fēng)干燥箱 （上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；梅特勒-托利多AB104-N型萬分之一天平；四氯汞鈉吸收液；氨基磺酸銨溶液（12g/L）；甲醛溶液（2g/L）；淀粉指示液；亞鐵氰化鉀溶液；乙酸鋅溶液；鹽酸副玫瑰苯胺顯色劑；碘溶液[C(1/2I2)=0.10mol/L]；硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液[C(Na2S2O3·5H2O)=0.100mol/L]；二氧化硫標(biāo)準(zhǔn)溶液（以上試劑均為分析純）。當(dāng)歸（生產(chǎn)批號：170801，亳州市佰世信中藥飲片公司）；25ml帶塞比色管；100ml天波牌容量瓶（A級）；酸式滴定管；試驗用水均為超純水。

2.2 樣品測定 稱取當(dāng)歸材粉末約1g研磨均勻的試樣，精密稱定，以少量水潤濕并移入100ml容量瓶中，然后加入20ml四氯汞鈉吸收液，浸提4h，加入亞鐵氰化鉀及乙酸鋅溶液各2.5ml，最后用水稀釋至100ml刻度，過濾后備用。取2.00ml樣品處理液于25ml比色管中，加四氯汞鈉吸收液至10ml，然后再加入1ml氨基磺酸銨溶液（12g/L）、1.5ml甲醛溶液（2g/L）及1ml鹽酸副玫瑰苯胺溶液，搖勻，25℃放置10min，用1cm比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點，于波長559nm處測吸光度。配制不同濃度的二氧化硫標(biāo)準(zhǔn)液，在同等試驗條件下測定器吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相應(yīng)的二氧化硫含量（或代入回歸方程計算得出二氧化硫的含量）然后進行計算[6-9]。

表1 二氧化硫標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品測定結(jié)果

3 測量不確定度的評估

3.1 數(shù)學(xué)模型 根據(jù)上述測量過程，二氧化硫含量的數(shù)學(xué)模型如下式中：X為樣品中二氧化硫的含量，μg/g；Ci為第i份樣品的樣液中二氧化硫的含量，μg；mi為第i份樣品質(zhì)量，g；為測定用樣液的體積，ml；V2為樣品定容體積，ml，n為測定樣品數(shù)，n=6。

3.2 不確定度來源的分析 根據(jù)數(shù)學(xué)模型分析，經(jīng)過對試驗整個過程的不確定因素分析，其不確定度可以歸納為5個方面[11-14]：①樣液中二氧化硫的含量（C）引入的不確定度u(C)；②質(zhì)量m引入的不確定度u(m)；③體積V2引入的不確定度u(V2)；④體積V1引入的不確定度u(V1)；⑤平行實驗結(jié)果(Ci)產(chǎn)生的不確定度u(Ci)。3.3不確定度分量的量化

3.3.1 樣液中二氧化硫的含量 （C）引入的不確定度u(C)即標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程中引入的不確定度u(C)：配制不同濃度的二氧化硫標(biāo)準(zhǔn)溶液，并對吸光度進行測定，測定數(shù)據(jù)見表1。

由表1擬合曲線得到方程為Y=0.023X+0.015，r=0.9985，取供試品溶液，平行測定2次，由直線方程求得Cpred=15.91μg，則Cpred不確定度u(C)為：u，此公式[15]中：0.0086，其中 S(A)為回歸標(biāo)準(zhǔn)差；Ai為標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度測定值；Afi為Ci對應(yīng)于擬合曲線上的響應(yīng)值；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線制備過程中測定了6個濃度，每個濃度測定2次，n=12；p為每份樣品測定次數(shù)，p=2；Ci為標(biāo)準(zhǔn)溶液含量測定值為標(biāo)準(zhǔn)溶液測定平均值872μg，Sxx為標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度殘差，502.72μg，則供試品合成標(biāo)準(zhǔn)相對不確定Urel(C)=u(C)/Cpred=0.3075/15.91=0.0193。

3.3.5 平行試驗結(jié)果產(chǎn)生的不確定度u(Ci)平行測定當(dāng)歸藥材6次，RSD=4.69%，計算得知當(dāng)歸藥材中殘留二氧化硫含量的最佳估計值為729.34μg·g-1。由貝塞爾公式求得單次測量標(biāo)準(zhǔn)差s(C2)為：s(Cj)由測量重復(fù)性導(dǎo)致的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u9646μg·g-1。因此，重復(fù)測定的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.4 計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 不確定度分量匯總見表2。

表2 各不確定度分量匯總表

3.5 計算擴展不確定度及報告不確定度 取95%的置信概率，包含因子k=2，則U95=0.02736×729.34×2=39.92μg/g，本次實驗含量測定結(jié)果可表示為（729.34±39.92）μg/g。

4 討論

鹽酸副玫瑰苯胺法測量當(dāng)歸藥材中二氧化硫殘留量的過程中，測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為19.96μg/g，在95%的置信概率下，取包含因子k=2，其擴展不確定度為39.92μg/g。樣品中二氧化硫含量是 729.34μg/g，其真實含量可表示為(729.34±39.92)μg/g。用傳統(tǒng)方法計算其相對誤差為5.47%，在允許范圍內(nèi)。

通過不確定度的評定可以看出，本方法測量結(jié)果的不確定度主要來自標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，其次來自于樣品的重復(fù)測定。這跟方法的精密度有關(guān)。因此，在測試樣品時，必須嚴格控制實驗條件，應(yīng)盡量使平行樣的質(zhì)量相近，并且操作規(guī)范，建議每個樣品平行測定次數(shù)不小于3次，以減少平行測定引入的不確定度。同時，盡可能使繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性好。