海帶多酚的提取分離純化及其體外活性

楊玉瑩，王 倩，郝豪奇，趙文英

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042)

隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)已成為威脅人類(lèi)健康的重要?dú)⑹种唬浒l(fā)生機(jī)制仍不明確，目前被人們認(rèn)可的發(fā)生機(jī)制主要有內(nèi)皮損傷學(xué)說(shuō)、脂質(zhì)侵潤(rùn)學(xué)說(shuō)等[1-3]。因此，臨床上常用的治療AS的藥物主要是采用抗氧化來(lái)防止內(nèi)皮損傷，降血脂來(lái)預(yù)防脂質(zhì)浸潤(rùn)，而他汀類(lèi)等藥物是臨床廣泛應(yīng)用的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物，但長(zhǎng)期服用對(duì)肝功能有一定危害，其他臨床常用藥物大多為合成藥，存在不良反應(yīng)多或有一定的肝、腎毒性等弊端[4-5]，因此，相關(guān)天然藥物的開(kāi)發(fā)已迫在眉睫。

海帶是一種經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值兼具的多年生海藻植物，食用及藥用歷史悠久，海帶預(yù)防和治療甲狀腺腫、降血脂及降血糖等作用在《本草綱目》等著作中均有記載[6]。海帶中含有海帶多糖、海帶多酚等多種物質(zhì)，有關(guān)海帶多糖的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用研究較多[7-8]，而海帶多酚僅抗氧化、抗腫瘤、抗菌以及化學(xué)防御等作用被研究[9-11]，其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本文中，筆者對(duì)海帶多酚進(jìn)行提取分離純化，并對(duì)海帶多酚的體外抗氧化和降血脂活性進(jìn)行初步研究，以期為海帶資源的綜合應(yīng)用研究以及海帶多酚用于抗動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硅膠GF254(化學(xué)純)，青島海洋化工有限公司；無(wú)水乙醇(醫(yī)用級(jí)試劑)，天津博迪化工股份有限公司；AB-8型大孔樹(shù)脂及其他試劑，均為市售分析純。硅膠G254薄層板(自制，硅膠GF254與0.8%羧甲基纖維素鈉溶液1∶ 3(g/L)攪勻鋪板)。

干海帶，購(gòu)于青島水產(chǎn)市場(chǎng)，清洗，晾曬烘干，粉碎至0.250 mm后備用。

LG16型雷勃爾高速離心機(jī)，北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；LabTech型紫外分光光度儀，北京萊伯泰科儀器有限公司；RE-5型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；Q6J3-W1000A型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；

1.2 海帶多酚的提取、分離與純化

1.2.1 海帶總多酚的提取

取適量粉碎過(guò)篩的海帶粉，經(jīng)乙醚脫脂后過(guò)濾，濾渣按預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的條件進(jìn)行超聲提取(按料液比1∶ 20，使用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇于30 ℃提取40 min)，提取液抽濾，所得濾液經(jīng)堿沉、酸沉后得中性提取液，使用FeCl3反應(yīng)[12]對(duì)所得海帶多酚粗品進(jìn)行定性鑒別。然后置于-4 ℃冰箱中放置24 h，于3 000 r/min離心5 min，上清液濃縮干燥至恒質(zhì)量，得海帶總多酚浸膏。

1.2.2 海帶多酚的薄層色譜鑒別

使用硅膠G254薄層板，以沒(méi)食子酸D為對(duì)照品，以海帶多酚提取液(精確配制質(zhì)量濃度為10.0 g/L)為供試品，展開(kāi)劑為氯仿-甲醇-甲酸-水(體積比為65∶ 25∶ 3∶ 4)，以香草醛-鹽酸試液為顯色劑，120 ℃烘箱內(nèi)加熱數(shù)分鐘后，于自然光下檢視。

1.2.3 海帶總多酚的含量測(cè)定

海帶總多酚含量采用Folin-Ciocalteu(FC)法[13]測(cè)定。取海帶多酚樣品溶液，依次加入蒸餾水、FC顯色劑，搖勻后加入Na2CO3溶液，室溫下避光放置，于765 nm處測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，即Y=0.012 5X+0.046 0 (R2=0.999 2)，質(zhì)量濃度范圍為12.26～65.23 mg/L，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量。平行測(cè)定3次。

1.2.4 海帶多酚成分的分離和純化

采用大孔樹(shù)脂AB-8型柱吸附法對(duì)海帶中多酚成分進(jìn)行分離純化。

以體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液為溶劑，將海帶多酚樣品配制成0.1 g/mL的樣品液。以1 mL/min的流速向樹(shù)脂柱中加入樣品液，吸附飽和后，先使用去離子水洗掉大部分水溶性雜質(zhì)，再使用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫。分段收集洗脫液于已編號(hào)的小玻璃管中(每管20 mL)，當(dāng)收集到的液體無(wú)FeCl3顏色反應(yīng)后，換洗脫液(流速1 mL/min)。以各玻璃管編號(hào)(洗脫體積)為橫坐標(biāo)，多酚含量為縱坐標(biāo)，繪制解吸曲線。

1.3 海帶多酚體外活性研究

1.3.1 清除DPPH·能力

精密稱(chēng)取20 mg海帶多酚各組分樣品，以30%乙醇定容至100 mL，配制質(zhì)量濃度分別為0.1、1.0和5.0 mg/mL的樣品溶液。

參照文獻(xiàn)[14]方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。移取各樣品溶液2 mL以及同體積DPPH·溶液(5×10-5mol/L，溶解于無(wú)水乙醇)混合，搖勻，靜置30 min，517 nm處測(cè)其吸光度(A)。以相應(yīng)溶液作為空白對(duì)照(A空白)，各樣品各濃度An設(shè)3組平行，計(jì)算各組分清除DPPH·的清除率，見(jiàn)式(1)。

(1)

1.3.2 清除·OH的能力

(2)

1.3.3 抗亞油酸氧化能力

采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARs)法[16]衡量海帶各組分抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。

配制質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的樣品溶液。海帶各組分樣品溶液中，依次加入亞油酸溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS，0.05 mol/L，pH=7.4)及去離子水，混勻，避光培養(yǎng)，以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照。

每隔24 h，從上述溶液中精確取樣1.0 mL，加入三氯乙酸溶液，靜置，加入硫代巴比妥酸溶液，混勻，沸水浴加熱。室溫下冷卻后加入正丁醇，搖勻并離心，上清液在532 nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定10 d。設(shè)3組平行，計(jì)算各組分的抗亞油酸氧化能力。

1.3.4 體外降血脂活性初步研究

配制質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的樣品溶液。向模擬體內(nèi)腸環(huán)境的溶液中加入1 mL各樣品溶液，各樣品溶液中分別加入?；悄懰徕c溶液(1 mmol/L，以pH 6.24的PBS配制)，37 ℃振蕩消化，離心，取上清液以備分析。以同濃度考來(lái)烯胺的60%乙醇(體積分?jǐn)?shù))溶液為陽(yáng)性對(duì)照，60%乙醇溶液為空白對(duì)照。

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 海帶多酚的提取、分離與純化

2.1.1 海帶多酚粗品的薄層色譜(TLC)鑒別

點(diǎn)樣、顯色后的薄層板如圖1所示。由圖1可知：樣品相應(yīng)斑點(diǎn)與沒(méi)食子酸斑點(diǎn)的位移相同，結(jié)合酚類(lèi)物質(zhì)在加入FeCl3后特有的藍(lán)綠色顏色反應(yīng)，可以判定所提取出的海帶多酚粗品具有酚類(lèi)物質(zhì)的共性。

A—沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品；B—海帶總多酚樣品1；C—海帶總多酚樣品2圖1 海帶多酚的薄層色譜Fig.1 TLC of polyphenols in Laminaria japonica

2.1.2 海帶多酚成分的分離和純化

使用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，分段收集洗脫液于接收管中并依次編號(hào)(每管20 mL)，洗脫液的淋洗順序依次為15%乙醇、30%乙醇、45%乙醇、60%乙醇、75%乙醇和90%乙醇。大孔樹(shù)脂洗脫液中，海帶多酚含量隨接收管編號(hào)(洗脫液體積)變化曲線見(jiàn)圖2。結(jié)合TLC實(shí)驗(yàn)，將相同斑點(diǎn)位置的各管樣品收集液合并，并分別命名為Fr1、 Fr2、 Fr3、 Fr4和 Fr5。

15%乙醇(1～16號(hào));30%乙醇(17～45號(hào))；45%乙醇(46～96號(hào))；60%乙醇(97～143號(hào));75%乙醇(144～183號(hào))；90%乙醇(184～202號(hào))圖2 海帶多酚解吸曲線Fig.2 Desorption curve of polyphenol compositions in Laminaria japonica

由圖2可知：隨著洗脫液極性的變化，不同極性的海帶多酚依次被洗脫出來(lái)，呈現(xiàn)出5個(gè)較為明顯的峰。根據(jù)大孔樹(shù)脂分離原理，先被洗脫下來(lái)的多酚成分具有較大的極性及分子量，而多酚的極性及分子量受多酚聚合度的影響，聚合度越大，其極性和分子量越大。隨著洗脫液中乙醇比例的增大(即流動(dòng)相極性的減小)，洗脫下來(lái)的多酚成分極性和分子量逐漸減小，聚合程度逐漸降低，最終多酚按照分子量大小的差異以及不同極性組分容量因子的不同先后被洗脫出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)多酚組分的相互分離。

2.2 海帶多酚體外活性研究

2.2.1 海帶多酚各組分清除DPPH·能力

考察海帶多酚各組分對(duì)DPPH·的清除率，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：在所考察的質(zhì)量濃度范圍(0.1～5.0 mg/mL)內(nèi)，海帶多酚組分Fr5的抗氧化能力最強(qiáng)，其對(duì)DPPH·的清除率分別為5.74%、12.79%和13.64%，其次為Fr4(4.89%、9.12%和11.35%)，F(xiàn)r3(4.58%、6.99%和6.53%)，F(xiàn)r2(1.20%、1.65%和2.44%)，F(xiàn)r1(0.68%、0.87%和2.04%)，且海帶多酚各組分的抗氧化能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)。海帶多酚提取物Fr1、Fr2在低、中濃度時(shí)幾乎無(wú)DPPH·清除能力，在高濃度時(shí)有微弱的抗氧化能力，而Fr3、Fr4和Fr5即使在低濃度仍具有較明顯的抗氧化能力。因此可以推測(cè)，海帶多酚的分子量或極性越小，抗氧化能力越強(qiáng)，這可能是由于多酚聚合程度影響了其空間構(gòu)象，從而影響了酚羥基的活性。

圖3 海帶多酚組分的DPPH·清除能力Fig.3 DPPH· scavenging activities of different poly- phenols compositions in Laminaria japonica

2.2.2 海帶多酚各組分清除·OH能力

考察海帶多酚各組分對(duì)·OH的清除率，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：海帶多酚組分Fr5的抗氧化能力最強(qiáng)并且其對(duì)·OH的清除率與樣品濃度呈正相關(guān)，在所考察的范圍(0.1～5.0 mg/mL)內(nèi)，對(duì)·OH的清除率依次為5.74%、12.79%和15.64%，其次為Fr4(4.89%、9.12%和12.35%)，F(xiàn)r3(5.47%、8.17%和11.01%)，F(xiàn)r2(0.28%、2.27%和2.66%)，F(xiàn)r1(0.23%、0.54%和0.92%)。本實(shí)驗(yàn)得出的海帶多酚·OH清除能力結(jié)果與上述DPPH·清除率的測(cè)定結(jié)果幾乎一致，即同種濃度下，海帶多酚組分清除·OH能力大小順序?yàn)镕r5、Fr4、Fr3、Fr2、Fr1。

圖4 海帶多酚組分的·OH清除能力Fig.4 ·OH scavenging activities of different polyphenol compositions in Laminaria japonica

2.2.3 海帶多酚各組分抗亞油酸氧化能力

生物膜脂質(zhì)中含有較多的多不飽和脂肪酸，易發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化而產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)過(guò)氧化物，損傷膜的功能與結(jié)構(gòu)，破壞人體細(xì)胞正常生理功能，引起動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病。因此，以含共軛雙鍵的亞油酸為模型，實(shí)現(xiàn)海帶多酚的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力大小的測(cè)定具有重要意義。

采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARs)法測(cè)定海帶多酚各組分抗亞油酸氧化活性，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：海帶多酚各組分均具有一定的抗亞油酸氧化能力，且在實(shí)驗(yàn)考察的前5天，抗亞油酸氧化能力與時(shí)間呈正相關(guān)，各組分抗氧化能力大小的順序?yàn)镕r3、Fr5、Fr4、Fr1和Fr2。在第5～8天，各組分的抑制能力變化趨于平緩，從第8天開(kāi)始，所有組分的抗亞油酸氧化能力均呈下降趨勢(shì)，這說(shuō)明隨著樣品消耗量的增多，亞油酸自身氧化的速度和程度高于各組分抗亞油酸氧化的速度和程度，亞油酸被繼續(xù)氧化。因此，海帶多酚各組分可連續(xù)7 d保持抗亞油酸氧化作用。

圖5 海帶多酚組分抗亞油酸氧化活性測(cè)定Fig.5 Anti-linoleic acid oxidation of different polyphenol compositions in Laminaria japonica

2.2.4 海帶多酚體外降血脂活性的初步研究

通過(guò)測(cè)定海帶多酚各組分結(jié)合牛黃膽酸鈉的能力，對(duì)其體外降血脂活性進(jìn)行初步研究，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：在相同條件下，F(xiàn)r1及Fr2與?；悄懰徕c無(wú)結(jié)合能力(分別為0.73%、0.93%)，F(xiàn)r3結(jié)合能力較微弱(4.58%)，而Fr4和Fr5雖具有結(jié)合能力且結(jié)合能力基本相近(分別為15.26%、17.11%)，但仍不及陽(yáng)性對(duì)照藥物考來(lái)烯胺(48.56%)。這說(shuō)明經(jīng)AB-8型大孔樹(shù)脂的分離純化，高極性的多酚組份(Fr1、Fr2及Fr3)不含有結(jié)合?；悄懰徕c的有效成分，而中低極性的多酚組分(Fr4、Fr5)則含有相應(yīng)的有效成分，這可能是由于海帶多酚的聚合程度影響了其酚羥基的數(shù)目，從而影響了其空間作用力，進(jìn)而影響了它們與?；悄懰徕c的結(jié)合能力。此結(jié)論在Zhou等[17]的研究中也得到證實(shí)，?；悄懰徕c的3個(gè)羥基能以離子鍵或氫鍵的形式與酚羥基相互作用。

圖6 海帶多酚組分結(jié)合?；悄懰徕c能力的比較Fig.6 Comparition of the binding capacity of different polyphenol compositions in Laminaria japonica to sodium taurocholate

3 結(jié)論

使用超聲法對(duì)海帶多酚進(jìn)行提取，經(jīng)AB-8型大孔樹(shù)脂洗脫后，可將海帶多酚按照聚合度或極性大小分成5個(gè)不同的組分(分別命名為Fr1、Fr2、Fr3、Fr4和Fr5)，初步實(shí)現(xiàn)了海帶多酚的分離純化，說(shuō)明AB-8型大孔樹(shù)脂適于海帶多酚的分離和純化。在對(duì)海帶多酚體外活性的研究中，聚合度大(分子量大或極性大，如Fr1、 Fr2)的多酚組分幾乎沒(méi)有抗氧化(0.68%、0.28%)或降血脂(0.73%、0.93%)活性，而聚合度小(分子量小或極性低，如Fr5)的多酚組分作用能力較強(qiáng)(抗氧化及降血脂活性分別可達(dá)15.64%、17.11%)，說(shuō)明海帶多酚的體外活性隨其聚合程度的降低而呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。

本研究為海帶資源的應(yīng)用研究以及海帶多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用研究提供了一定的參考，其他與海帶多酚成分發(fā)揮藥理活性的作用機(jī)制有待進(jìn)一步進(jìn)行多酚構(gòu)效關(guān)系的探究。