不同護(hù)膚技術(shù)組合對SKH-1小鼠皮膚光保護(hù)作用的初步研究

黃慧瑩 ，梁燕珊 ，吳美音 ，施琬 ，鄭亞美 ，陳亞非

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院針灸推拿，廣東廣州 510000；2.無限極（中國）有限公司，廣東廣州 510665；3.廣州宏韻醫(yī)藥科技股份有限公司，廣東廣州 510663

皮膚是人體最大的器官，覆蓋全身，能吸收、分泌、排泄、感覺、參與代謝等，同時(shí)具有重要的屏障和防御功能：一方面防止體內(nèi)水分，電解質(zhì)和其他物質(zhì)丟失，另一方面使體內(nèi)各種組織和器官免受物理性、機(jī)械性、化學(xué)性和病原微生物性的侵襲[1-3]。皮膚衰老是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為膚色黯淡，皮膚變薄、皺紋增多、彈性下降，毛細(xì)血管顯露，易脫屑、瘙癢，常見色斑及疣狀物，嚴(yán)重者甚至產(chǎn)生皮膚紫癜及癌變[4-5]。

陽光是一把雙刃劍，在帶來光明和能量的同時(shí)，其中的紫外線（ultraviolet，UV）也可導(dǎo)致皮膚光損傷。皮膚暴露于紫外線下會(huì)產(chǎn)生大量活性氧（Reactive Oxygen Specie，ROS）。正常情況下，UV 照射機(jī)體產(chǎn)生的ROS可被體內(nèi)抗氧化防御體系所清除。當(dāng)UV反復(fù)照射皮膚，超出機(jī)體抗氧化體系的防御清除能力時(shí)，累積的ROS可造成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)氧化損傷，從而導(dǎo)致一系列急慢性損傷表現(xiàn)。皮膚光損傷長期累積可導(dǎo)致光老化甚至是光致癌[6]。

皮膚光損傷嚴(yán)重影響了人們的美觀和健康，是人們普遍關(guān)注的熱點(diǎn)問題，對它的防治進(jìn)行研究十分有必要。在皮膚問題的治療和護(hù)理上，目前正在經(jīng)歷從傳統(tǒng)的單一護(hù)膚品治療向聯(lián)合治療，再向多學(xué)科綜合治療的轉(zhuǎn)變。皮膚問題既是局部變化，又是全身整體失衡的外在表現(xiàn)，護(hù)膚不僅僅是采取單一方法甚至極端方法即可奏效的。當(dāng)前，皮膚治療和護(hù)理的手段有很多，包括護(hù)膚品、口服美容食品及各類醫(yī)美技術(shù)等，采用多種技術(shù)手段的綜合治療有助于提高皮膚治療和護(hù)理效果。因此，如何將現(xiàn)有各種美麗技術(shù)與方法分門別類并有機(jī)地結(jié)合起來，取長補(bǔ)短，實(shí)現(xiàn)整體美麗是目前多學(xué)科、跨品類綜合運(yùn)用的迫切要求。

該實(shí)驗(yàn)研究周期為2017年5—7月，共選取SKH-1小鼠33只，以護(hù)膚品、美容技術(shù)和美容食品等不同技術(shù)及組合干預(yù)SKH-1小鼠皮膚光損傷過程，通過組織病理變化、表皮厚度變化等指標(biāo)初步評價(jià)不同護(hù)膚技術(shù)抗小鼠皮膚光損傷的作用差異，為提供更科學(xué)的護(hù)膚技術(shù)及其組合提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 護(hù)膚品：萃雅菁顏無痕煥能活膚液、萃雅菁顏無痕至臻彈力精華乳、萃雅菁顏無痕卓能修復(fù)晚霜，生產(chǎn)批號為16G25CAP01，均由無限極（中國）有限公司提供；美容食品：美姿力膠原蛋白果味飲料，生產(chǎn)批號為15F08A02H，由無限極（中國）有限公司提供；美容儀器：660 nm紅光美容儀（Syneron Beauty Inc，型號 90208），微電流美容儀（Carol Cole Company，型號 P0144791）；熒光燈管（FS40，National Biological Corp.，Twinsburg，OH）； 分光光度計(jì)（Luzchem Research，Inc，Ontario，Canada）； 紫外線強(qiáng)度檢測儀 （Oriel Instruments，Stratford，CT，USA）；福 爾 馬 林（Fisher，22-899-401）；石蠟（Tissue-Tek，62580-01）；乙醇（Fisher，A406p-4）；二甲苯（Fisher ，x3p-1gal）；蘇木精染液（Sigma，HHS32-1L）；伊紅染液（Anatech，832）。

1.1.2 動(dòng)物 SPF級 6～7周齡 SKH-1無毛小鼠，由Charles River提供，體重20 g左右。飼養(yǎng)于芝加哥大學(xué)SPF級動(dòng)物屏障室中，光照充足，自由飲食飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到芝加哥動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并在芝加哥大學(xué)完成。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 護(hù)膚品：活膚液100 μL/（只·次）；精華乳 0.1 g/（只·次）；晚霜 0.05 g/（只·次）。 使用棉簽涂抹并輕輕按摩至皮膚完全吸收為止。使用順序：活膚液→精華乳→面霜。

美容技術(shù)：①紅光美容技術(shù)：660 nm，3 min/次，1次/d；②微電流美容技術(shù)：使用 3檔，5 min/次，1次/d，每次使用前在皮膚上涂抹適量凝膠。

美容食品：300 μL/只/次，灌胃給藥，1 次/d。 給藥劑量是按《中藥藥理研究方法學(xué)》提供的人與小鼠等效劑量比值計(jì)算而得，即小鼠的等效劑量相當(dāng)于人的9.1倍，該灌胃劑量相當(dāng)于人體2支/d（即100 mL/60 kg）的用量。

不同護(hù)膚技術(shù)使用順序如下：食品→美容技術(shù)→護(hù)膚品。

將33只SKH-1無毛小鼠按體重隨機(jī)分成11個(gè)組，每組3只，分別為模型組（Model）和10個(gè)給藥組，給藥分組如下：護(hù)膚品組 （SC）、紅光美容技術(shù)組（RL）、微電流美容技術(shù)組（MC）、美容食品組（BF）、護(hù)膚品+紅光美容技術(shù)組（SC+RL）、護(hù)膚品+微電流美容技術(shù)組（SC+MC）、紅光美容技術(shù)+美容食品組（RL+BF）、微電流美容技術(shù)+美容食品組（MC+BF）、護(hù)膚品+紅光美容技術(shù)+美容食品組 （SC+RL+BF）、護(hù)膚品+微電流美容技術(shù)+美容食品組（SC+MC+BF）。

參考文獻(xiàn)[7-8]，除模型組外，各治療組按分組進(jìn)行給藥，連續(xù)給藥5 d。于實(shí)驗(yàn)第4天給藥前，使用UV于小鼠背部照射2.5 min（光源距離小鼠背部皮膚27 cm，輻射強(qiáng)度0.67 mW/cm2）。實(shí)驗(yàn)第6天不給藥，使用UV照射2.5 min后處死小鼠，觀察小鼠皮膚形態(tài)學(xué)變化，并取背部皮膚組織進(jìn)行病理分析。

1.2.2 HE染色 取一小塊小鼠背部皮膚組織，置于10%福爾馬林中固定過夜，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋、5 μm石蠟切片，蘇木精-伊紅染色。觀察皮膚的病理改變、測定表皮層厚度。

1.3 病理分析

①每個(gè)樣本片隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域用于表皮層厚度測量（×20）。②對于每個(gè)區(qū)域，各隨機(jī)選取5個(gè)測量點(diǎn)，通過ImageJ軟件分析對應(yīng)表皮層厚度。③計(jì)算各組的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用GraphPad Prism 6.01軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水平，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚形態(tài)學(xué)變化

通過肉眼觀察，Model組小鼠背部皮膚明顯粗糙萎縮、變薄，缺乏光澤，沒有彈性，表面紋理增多，且皮膚有破潰和紅斑表現(xiàn)。與Model組比較，各治療組小鼠背部皮膚變得較為細(xì)膩，厚度增加，彈性恢復(fù)，表面皮膚紋理變淺、皺紋也有不同程度的減少。其中，以SC+RL+BF組皮膚改善較好，已明顯恢復(fù)紅潤光澤，厚度適中，具有良好的皮膚彈性（見圖1）。

圖1 各組小鼠皮膚形態(tài)學(xué)變化圖

2.2 皮膚組織病理學(xué)觀察與表皮層厚度測定

2.2.1 組織病理學(xué)觀察 Model組小鼠背部皮膚表皮層厚度減小，角質(zhì)層缺失較多，真皮層纖維彎曲、排列紊亂。RL、MC、BF 3組小鼠背部皮膚表皮層厚度無明顯變化，角質(zhì)層部分缺失，真皮層纖維較疏松。其余7個(gè)治療組小鼠背部皮膚表皮層增厚，結(jié)構(gòu)完整清晰，角質(zhì)層部分缺失較少，真皮層纖維排列整齊。結(jié)果表明，各治療組對角質(zhì)層缺失有一定的改善作用，使角質(zhì)層結(jié)構(gòu)趨于完整（見圖2）。

2.2.2 表皮層厚度測定 與Model組比較，除RL、MC、BF 3組外，其余各治療組小鼠的表皮層厚度均有不同程度的增加，尤以SC、SC+MC、RL+BF和SC+RL+BF四組對表皮厚度的改善作用最為顯著 （P＜0.05）（見表 1）。

圖2 各組小鼠背部皮膚組織病理圖（HE染色，×20）

表1 各組小鼠背部皮膚表皮層厚度測定[（±s），μm]

表1 各組小鼠背部皮膚表皮層厚度測定[（±s），μm]

注：*P＜0.05，**P＜0.01，vs Model組。

組別表皮層厚度M o d e l（n=3）S C（n=3）R L（n=3）M C（n=3）B F（n=3）S C+R L（n=3）S C+M C（n=3）R L+B F（n=3）M C+B F（n=3）S C+R L+B F（n=3）S C+M C+B F（n=3）1 5 4.9 9 3±1 2.5 2 5(2 7 1.0 3 8±3 5.6 4 2)**1 5 3.7 2 3±6.9 9 3 1 4 2.0 8 5±2 6.9 4 2 1 5 5.7 9 0±2 5.7 9 0 2 5 8.9 8 9±4 2.2 3 6(3 0 3.2 1 3±4 7.0 8 2)**(1 9 0.7 4 0±1 3.1 1 3)*1 7 9.2 2 0±2 2.4 3 1(2 9 4.1 9 0±6 6.6 7 0)*2 0 2.2 7 5±5 9.3 0 5

3 討論

表皮是皮膚的外層，能防止外界異物入侵，過濾、吸收紫外線，分裂增生細(xì)胞等，皮膚老化過程中表皮層逐漸變薄，天生表皮層較薄的人皮膚也更容易出現(xiàn)衰老癥狀，因此保證一定的表皮層厚度能預(yù)防或延緩衰老。角質(zhì)層是表皮的最外層，皮膚的第一道防護(hù)網(wǎng)，能阻擋外界微生物的侵襲和自然水分的流失，同時(shí)具有一定的抗氧化功能[9-10]，對皮膚屏障作用的發(fā)揮具有重要意義[11]。角質(zhì)層缺失時(shí)肌膚水分流失加速，容易產(chǎn)生缺水、干燥、粗糙、彈性降低等一系列皮膚問題，因此保持角質(zhì)層的完整性對維持皮膚的屏障功能、防止光損傷具有重要意義。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：①表皮層厚度：模型組的表皮層厚度為[（154.993±12.525）μm]。 使用單一護(hù)膚品[SC：（271.038±35.642）μm]、護(hù)膚品+微電流美容技術(shù)[SC+MC：（303.213±47.082）μm）]、紅光美容技術(shù)+美容食品[RL+BF：（190.740±13.113）μm]、護(hù)膚品+紅光美容技術(shù)+美容食品 [SC+RL+BF：（294.190±66.670）μm]能明顯提升光損傷小鼠表皮層厚度（P＜0.05），初步提示護(hù)膚品和不同護(hù)膚技術(shù)組合使用對光損傷小鼠皮膚表皮層厚度的改善作用更好。然而單一的紅光技術(shù)、微電流技術(shù)和美容食品則對表皮層厚度影響不大，經(jīng)分析這可能與治療時(shí)間較短有關(guān)。其中，美容技術(shù)激活細(xì)胞，對皮膚的再生修復(fù)方面作用并非一朝一夕能完成，美容食品調(diào)節(jié)人體并體現(xiàn)在面部肌膚上需要一個(gè)較長期的過程。②角質(zhì)層結(jié)構(gòu)完整性：組織病理結(jié)果提示，不同護(hù)膚技術(shù)及其組合干預(yù)后，光損傷小鼠皮膚內(nèi)在結(jié)構(gòu)、角質(zhì)層完整性、皮膚再生狀況、真皮層纖維排列和表皮層厚度均有較為明顯的改善趨勢，此在某種程度上類似受損后的皮膚再生，這些變化發(fā)生后皮膚可能出現(xiàn)自我修復(fù)，從而達(dá)到真皮膠原纖維、彈性纖維再生重塑的作用，其中尤以護(hù)膚品+微電流美容技術(shù)、護(hù)膚品+紅光美容技術(shù)、護(hù)膚品+微電流美容技術(shù)+美容食品、護(hù)膚品+紅光美容技術(shù)+美容食品更為明顯。

吳海游等人[12]通過紫外線照射導(dǎo)致小鼠皮膚損傷的實(shí)驗(yàn)觀察3種含輔酶Q10的防曬劑具有抗小鼠皮膚紫外線損傷的作用，模型組小鼠皮膚角質(zhì)層則明顯脫落，涂抹防曬劑后，角質(zhì)層脫落得到不同程度的改善。孫程等人[13]采用D-半乳糖聯(lián)合紫外照射誘導(dǎo)KM小鼠的皮膚衰老模型，導(dǎo)致模型組小鼠表皮變?。?.56±1.47）μm，茶樹提取物 TTE 經(jīng)皮給藥后，表皮厚度顯著變厚，TTE低劑量組和高劑量組的表皮厚度（16.81±3.39）μm 和 （26.80±3.93）μm。 該實(shí)驗(yàn)以紫外線照射造成小鼠皮膚光損傷，表現(xiàn)為粗糙、變薄，表皮層厚度減小，角質(zhì)層缺失，真皮層纖維排列紊亂，表明模型符合光損傷模型特點(diǎn)；而經(jīng)不同護(hù)膚技術(shù)及其組合干預(yù)后，光損傷小鼠皮膚的外在表現(xiàn)、以及表皮層厚度、角質(zhì)層缺失狀況、真皮層纖維排列方式等均有不同程度的改善，與單一使用防曬劑或護(hù)膚品相比，對皮膚的光保護(hù)作用更加系統(tǒng)和全面。

該實(shí)驗(yàn)所選用護(hù)膚品的核心功效成分為多肽復(fù)合體（寡肽-1、棕櫚酰五肽、肌肽等），具有良好的抵抗自由基和皮膚修復(fù)能力?？诜廊菔称返暮诵墓πС煞譃槟z原蛋白，通過內(nèi)源性補(bǔ)充，可提供給皮膚細(xì)胞新陳代謝所需營養(yǎng)因子。紅光美容技術(shù)為LED紅光，波長660 nm，又稱生物活性光，可有效激活逐漸退化的皮膚細(xì)胞活性，激發(fā)人體自身修復(fù)功能；同時(shí)，細(xì)胞中的線粒體對紅光吸收最大，在紅光照射后線粒體的過氧化氫酶的活性增加，進(jìn)而增加細(xì)胞的新陳代謝，使糖原含量增加，蛋白合成增加和三磷酸腺苷（ATP）分解增加，從而加強(qiáng)細(xì)胞新生[14]。微電流美容技術(shù)則是利用儀器所產(chǎn)生的微電流作用于皮膚時(shí)，會(huì)在局部皮膚內(nèi)形成一種低量電環(huán)流，這種低電環(huán)流模擬人體內(nèi)生物電的自然流動(dòng)情況，具有即時(shí)效果和累積效果；微電流通過面部刺激，將輕柔的電流經(jīng)皮膚、組織一直到傳送到面部肌肉中，刺激ATP的產(chǎn)生，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白（膠原蛋白和彈性蛋白等）的再生[15]。

綜上所述，預(yù)防或延緩皮膚衰老并不能只采用單一的護(hù)膚品、美容技術(shù)或者美容食品，應(yīng)從整體出發(fā)，將多種護(hù)膚技術(shù)有機(jī)結(jié)合。該實(shí)驗(yàn)中護(hù)膚品、美容技術(shù)及美容食品2～3種組合對皮膚光損傷可起到更全面的保護(hù)效果，多種護(hù)膚技術(shù)組合能更好的發(fā)揮各自的優(yōu)勢，這為護(hù)膚技術(shù)的組合應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。