鄒亞麗，唐慧安，李長江，呼麗萍，王弋博

（1.天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，天水師范學(xué)院新型分子材料設(shè)計(jì)與功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅大櫻桃工程技術(shù)研究中心，甘肅 天水 741001；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，江西 南昌 330045）

近20年來，糖尿病發(fā)病率迅速上升，以2型糖尿?。═2DM）更甚。[1]臨床上T2DM主要用阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇為代表的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物進(jìn)行治療，其作用機(jī)理是形成酶-抑制劑復(fù)合物而使酶失活以阻礙碳水化合物的代謝，控制血糖含量。這類化合物具有一定的副作用，表現(xiàn)為：長期服用阿卡波糖等藥物后會(huì)產(chǎn)生腸胃脹氣，惡心、腹痛、胃疼等腸胃不良癥狀，還產(chǎn)生肝損害和藥物性肝炎等毒副作用。[2-4]近年來研究發(fā)現(xiàn)釩化合物能增加機(jī)體組織對(duì)胰島素的敏感性，具有抗糖尿病、抗腫瘤及神經(jīng)保護(hù)等多方面功能，且有機(jī)釩配合物的降糖效果優(yōu)于無機(jī)釩化合物，[5]但呋喃甲酸類氧釩[6]及氧釩羧酸類配合物也有一定的胃腸道毒副反應(yīng)，[7]高劑量的釩還可能使釩蓄積在線粒體內(nèi)，抑制線粒體呼吸功能氧化應(yīng)激和呼吸抑制導(dǎo)致機(jī)體中毒，[8]因此低毒的有機(jī)羧酸或有抗糖尿病活性的有機(jī)藥物為配體的釩配合物，已成為目前釩配合物降糖的熱點(diǎn)之一。研究表明黃酮配合物可作為抗氧化劑減輕或消除釩對(duì)線粒體的毒性作用，消除釩配合物對(duì)細(xì)胞連接的破壞，[9-10]本研究基于此采用化學(xué)方法合成了楊梅黃酮合氧釩，以紫外光譜、紅外光譜等手段對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并探究了其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用和其酶催化動(dòng)力學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-葡萄糖苷酶（美國Sigma公司），阿卡波糖（上海史瑞可生物有限公司）；二甲雙胍（Sell?ick公司），4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG，上海葉源生物）；3,5-二硝基水楊酸、苯酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉等藥品均為上海生工產(chǎn)品；楊梅黃酮（武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司），紫外分光光度計(jì)（lambda35，PerkinEl?mer），傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet 6700，Thermo Fisher），酶標(biāo)儀 （Multiskan FC，Thermo Fisher）

1.2 合成方法

將2.9697g(0.0162mol)V2O5與6.06 mLH2SO4(17.35 mol/L，0.105mol)加入圓底燒瓶，90℃加熱并攪拌60min.冷卻加少量蒸餾水稀釋，加入1.4694g(0.0162mol)H2C2O4，加熱并攪拌，反應(yīng)溫度60℃，時(shí)間10h，得硫酸氧釩溶液。然后將26.8191g(0.1050mol)Ba(Ac)2配成溶液，邊攪拌邊滴加到硫酸氧釩溶液中，過濾后將其加熱濃縮后置于50℃電熱真空干燥箱24h得醋酸氧釩晶體。將0.3182(1mmol)楊梅黃酮與50mL乙醇加入圓底燒瓶，升溫至65℃加熱并攪拌60min，到楊梅黃酮完全溶解，緩慢滴加50mL含0.1190g(0.5mmol)醋酸氧釩的無水乙醇溶液后，緩慢加入10 mL乙醇鈉溶液，65℃回流反應(yīng)3h，出現(xiàn)褐色沉淀，過濾洗滌，將生成物置于50℃真空干燥箱內(nèi)干燥24h，得楊梅黃酮合氧釩，其結(jié)構(gòu)式如下：

1.3 結(jié)構(gòu)表征

圖1 楊梅黃酮（a）和楊梅黃酮合氧釩配合物（b）結(jié)構(gòu)

配合物采用KBr壓片法，在400～4000cm-1范圍內(nèi)炒采集楊梅黃酮及楊梅黃酮合氧釩配合物的紅外光譜；取一定量楊梅黃酮及楊梅黃酮合氧釩配合物溶于丙酮中，溶液濃度在10-4mol/L以下，在200～500 nm范圍內(nèi)掃描。

1.4 楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及其催化動(dòng)力學(xué)研究

取20μL 2mg/mL楊梅黃酮合氧釩，加入pNPG（0.116 mol/L）20μL，混勻，37℃水浴恒溫60min，反應(yīng)液中再加入α-葡萄糖苷酶0.1U/mL 50μL，37℃水浴恒溫30min，最后加入1mol/L的Na2CO3溶液100μL，終止反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀在405nm波長下測(cè)定OD值。空白組磷酸鹽PBS緩沖液(0.2mol/mL，pH6.8)代替酶液，對(duì)照組以二甲基亞砜代替樣液，阿卡波糖為陽性參照物，根據(jù)公式計(jì)算各濃度下α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制率。[11]

式中：A為樣品的吸光值；A’為樣品空白吸光值;A0為對(duì)照組吸光值；A0’為對(duì)照組空白吸光值。

采用Line weaver-Burk曲線作圖法判斷楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類型，固定α-葡萄糖苷酶溶液濃度，分別改變pNPG濃度（2.5、5、7.5、10μmol/mL）及楊梅黃酮合氧釩水溶液濃度（0.8、1.2、1.6 mg/m L），以 1/v對(duì) 1/[S]作圖，得到Lineweaver-Burk曲線（見圖6）。[11]

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（X±s）的形式表示，采用LSD法進(jìn)行數(shù)據(jù)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅黃酮合氧釩結(jié)構(gòu)表征分析

2.1.1 紅外光譜分析

楊梅黃酮和楊梅黃酮合氧釩的紅外吸收光譜見圖2（a）和2（b）。由圖2（a）和2（b）可知，二者的紅外吸收光譜明顯不同，楊梅黃酮在3410cm-1處峰形尖銳，歸屬為νO-H的伸縮振動(dòng)，而楊梅黃酮合氧釩在3369cm-1處出現(xiàn)較寬鈍的νO-H吸收峰，且強(qiáng)度增加，原因是楊梅黃酮酚羥基與配位水分子形成氫鍵，使νO-H向低頻移動(dòng)，且強(qiáng)度增加。在515cm-1出現(xiàn)了配位水的振動(dòng)吸收，進(jìn)一步佐證了配合物中配位水的存在。楊梅黃酮4號(hào)位羰基在1660cm-1處有吸收峰，而楊梅黃酮合氧釩則在1595cm-1處有吸收峰，向低波數(shù)移動(dòng)了65cm-1，表明配體4號(hào)位羰基與釩原子配位成鍵。楊梅黃酮在1200cm-1處出現(xiàn)峰，歸屬為酚羥基νC-O的伸縮振動(dòng)，楊梅黃酮合氧釩移至1112cm-1，向低波數(shù)移動(dòng)了88cm-1，原因是楊梅黃酮酚羥基提供電子與釩離子配位；楊梅黃酮合氧釩在614cm-1新出現(xiàn)的峰歸屬為V-O鍵的伸縮振動(dòng)，進(jìn)一步表明配體與釩陽離子間配位鍵的形成。

圖2 楊梅黃酮(a)和楊梅黃酮合氧釩(b)紅外圖譜

2.1.2 紫外光譜分析

楊梅黃酮和楊梅黃酮合氧釩紫外光譜見圖3（a）和3（b）。楊梅黃酮在200～500nm范圍存在兩個(gè)主要紫外吸收帶，最大吸收波長分別為210nm和373nm，而楊梅黃酮氧釩的兩個(gè)紫外吸收帶則均向長波方向移動(dòng)，最大吸收波長分別為238nm和423nm；分別由210nm移至238nm和由373nm移至423nm，且在357.5nm處出現(xiàn)新峰，這表明楊梅黃酮氧釩對(duì)楊梅黃酮B環(huán)共軛效應(yīng)增強(qiáng)較大，對(duì)A環(huán)的影響相對(duì)較小。據(jù)紅外光譜可知，A環(huán)羰基是參與配位的，又從楊梅黃酮的結(jié)構(gòu)式可看出，另一個(gè)參與配位的可以是3-羥基，也可以是5-羥基。因3-羥基是與B環(huán)共軛，而5-羥基與A環(huán)共軛，且楊梅黃酮氧釩配合物對(duì)B環(huán)共軛效應(yīng)增強(qiáng)較大，因此可判斷是楊梅黃酮的3-羥基而非5-羥基參與配位。

圖3 楊梅黃酮（a）和楊梅黃酮合氧釩(b)紫外圖譜

2.2 楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用及其酶催化動(dòng)力學(xué)特征

由圖4所示，隨著楊梅黃酮合氧釩濃度的增大，其對(duì)a-葡萄糖苷酶活性的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，楊梅黃酮合氧釩濃度為0.4 mg/mL時(shí)對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制率高，達(dá)到91.91%，是同濃度下陽性對(duì)照阿卡波糖抑制率的2.45倍，通過計(jì)算得到其IC50為271mg/L.

研究表明天然黃酮類活性成分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有顯著抑制作用，[12-13]本研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率顯著高于阿卡波糖（p＜0.005）。劉合生等對(duì)比了楊梅素、楊梅苷和氯化矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)三者中楊梅苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用最弱，楊梅苷疏水性的降低可能減弱了它與酶的親和力。[14]本研究中合成的楊梅黃酮合氧釩B環(huán)3′4′5′攜帶3個(gè)羥基，且是雙核黃酮氧釩配合物，由于共軛效應(yīng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)供電性，同時(shí)金屬配位原子的協(xié)同效應(yīng)，亦增強(qiáng)了楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制效果。

圖5 楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線

對(duì)楊梅黃酮合氧釩抑制α-葡萄糖苷酶作用進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析，Lineweaver-Burk曲線結(jié)果表明，當(dāng)楊梅黃酮合氧釩濃度增加時(shí)，抑制作用的表觀Km值增大，Vmax不變，說明楊梅黃酮合氧釩對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型屬于典型的競爭性抑制，其競爭性抑制作用的強(qiáng)弱取決于抑制劑與底物競爭酶的濃度，表明楊梅黃酮合氧釩與α-葡萄糖苷酶的底物pNPG有結(jié)構(gòu)上的相似性，能與pNPG競相爭奪α-葡萄糖苷酶分子上的結(jié)合位點(diǎn)，從而產(chǎn)生酶活性的可逆的抑制作用，而劉合生等研究發(fā)現(xiàn)楊梅苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制為混合型競爭，可能與楊梅苷3號(hào)位碳原子形成鼠李糖苷有關(guān)。[14]

3 結(jié) 論

本研究合成了新型有機(jī)氧釩的配合物楊梅黃酮合氧釩，通過紅外光譜、紫外光譜對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，楊梅黃酮合氧釩可抑制α-葡萄糖苷酶活性，其抑制率達(dá)95.60%，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型屬于的競爭性抑制，構(gòu)效關(guān)系表明，楊梅黃酮合氧釩A環(huán)含有3個(gè)游離羥基,且C環(huán)3號(hào)位羥基具有更強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，由于含有金屬釩可改善胰島素抵抗，[15]且楊梅黃酮合氧釩能提高釩的溶解性，因此是一種有前景的新型α-葡萄糖苷酶抑制劑。