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    福建省耐多藥結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺的耐藥水平與基因型特征分析

    2018-12-04 08:57:06林淑芳魏淑貞趙永林建林勇明
    中國防癆雜志 2018年12期
    關(guān)鍵詞:耐藥性結(jié)核病福建省

    林淑芳 魏淑貞 趙永 林建 林勇明

    吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)是一線抗結(jié)核藥物化療方案的柱石,在酸性環(huán)境下對半休眠結(jié)核分枝桿菌(MTB)和持留MTB具有獨特的滅菌作用,與異煙肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampicin,RFP)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)聯(lián)合用于敏感結(jié)核病化療可將療程縮短為6個月。PZA除了具有與眾不同的藥理作用之外,還與貝達喹啉和PA-824 等2個新藥具有協(xié)同抗結(jié)核作用[1-3],因而PZA也作為非常重要的藥物用于治療耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)。盡管PZA對治療結(jié)核病至關(guān)重要,但是因為PZA對體外藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)條件要求比較高,限制了其耐藥性檢測的普遍開展,而且沒有像INH、RFP和EMB一樣納入到常規(guī)耐藥監(jiān)測當(dāng)中,所以全球?qū)ZA的耐藥性研究相對比較少[4]。因此,了解MDR-TB對PZA的耐藥現(xiàn)狀對于指導(dǎo)臨床合理用藥非常有意義。

    結(jié)核病分子流行病學(xué)研究顯示,全球結(jié)核病流行主要由北京家族、T家族、H家族、CAS家族、LAM家族等菌株群引起,目前多個國家和地區(qū)報道北京基因型是主要優(yōu)勢基因型[5-6]。北京基因型導(dǎo)致多個國家MDR-TB的暴發(fā)。間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)(Spoligotyping)是鑒定北京基因型的金標(biāo)準(zhǔn),具有可靠、高效和數(shù)字化等特點而被廣大實驗室廣泛應(yīng)用[7-8]。國內(nèi)外對MDR-MTB北京基因型菌株與對PZA耐藥性的關(guān)系研究不多,因此,筆者應(yīng)用Spoligotyping技術(shù)鑒定福建省MDR-MTB的基因型,了解基因型分布情況和北京基因型流行情況,同時分析對PZA的耐藥水平及與不同基因型菌株間的關(guān)系。

    材料和方法

    一、菌株來源

    收集2007—2008年福建省耐藥監(jiān)測點40株MDR-MTB臨床分離株,以及2010—2011年第五輪全球基金結(jié)核病項目福建省耐藥監(jiān)測點79株MDR-MTB臨床分離株,共計119株。MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由國家結(jié)核病參比實驗室提供。

    二、藥敏試驗

    采用Guidelinesforsurveillanceofdrugresis-tanceintuberculosis[9]推薦的比例法對INH、鏈霉素(Sm)、RFP、EMB等4種抗結(jié)核藥物進行藥敏試驗。采用WHO[10]推薦的BACTEC MGIT 960系統(tǒng)法(簡稱“MGIT 960”)檢測MDR-MTB 對PZA的耐藥性,濃度為100 μg/ml。

    三、細菌DNA制備

    從羅氏(L-J)培養(yǎng)基中生長良好的MTB取一菌環(huán),溶于200 μl的TE緩沖液(pH 8.3)中,在旋渦振蕩器中振蕩均勻后,放在95 ℃水浴鍋中15 min后,以10 000×g離心5 min,取上清。

    四、間隔區(qū)寡核苷酸基因分型

    (1)直接重復(fù)(DR)間隔區(qū)特異性核苷酸探針序列共43條,見文獻[11]。DR間隔區(qū)擴增引物序列:DRa:5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′; DRb:5′-CCGAGAGGGGACGGAAC-3′。其中,DRa的5′端用生物素標(biāo)記,用于雜交后發(fā)光檢測。(2)43條探針按順序用Miniblotter標(biāo)記在Biodync C膜上(美國Pall 公司)。(3)DR間隔區(qū)PCR擴增體系為50 μl,PCR預(yù)混液25 μl,DRa和DRb各2 μl,DNA模板5 μl,去離子水16 μl。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 50 s,60 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min,共35個循環(huán);72 ℃延伸8 min。同時擴增H37Rv和BCG作為陽性對照。(4)用Miniblotter與探針垂直方向加入DR間隔區(qū)PCR擴增產(chǎn)物、H37Rv和BCG,空白對照。雜交爐內(nèi)50 ℃雜交1 h。(5)雜交膜處理后,加入鏈霉親和素-過氧化物酶偶聯(lián)物(CDP-Star,購自美國GE公司)孵育,42 ℃孵育30 min,在暗室內(nèi)曝光、顯影。(6)雜交結(jié)果陽性用“1”,陰性用“0”表示,錄入到Excel表以二進制和八進制格式描述每株菌的分型結(jié)果。Spoligotyping結(jié)果提交至SpolDB 4.0(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVITDemo)[12]和國際數(shù)據(jù)庫MIRU-VNTR plus(http://www.miru-vntrplus.org)[13]。

    五、統(tǒng)計學(xué)處理

    應(yīng)用BioNumerics 5.0進行分析,采用UPGMA系數(shù)進行聚類分析。應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析,菌株基因型與其耐藥性之間的差異性分析采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、PZA耐藥情況

    119株MDR-MTB菌株應(yīng)用MGIT 960進行PZA藥敏試驗,結(jié)果顯示44株對PZA耐藥,耐藥率為36.97%(44/119)。耐PZA菌株對Sm的耐藥率為70.45%(31/44),高于對PZA敏感菌株對Sm的耐藥率[50.67%(38/75)],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.45,P=0.035);耐PZA菌株對EMB的耐藥率為81.82%(36/44),高于對PZA敏感菌株對EMB的耐藥率[52.00%(39/75)],差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.58,P=0.001)。

    二、MDR-MTB菌株的基因型構(gòu)成

    119株MDR-MTB菌株經(jīng)Spoligotyping進行基因分型,結(jié)果顯示分為2個基因群,即北京基因型和非北京基因型;共鑒定出9個基因型(即北京基因型和8個非北京基因型);另有8株菌株的基因型在SpolDB 4.0數(shù)據(jù)庫中檢索不到相同序列,判為新發(fā)現(xiàn)的基因型,經(jīng)聚類分析,均為非北京基因型的獨特類型。其中,北京基因型菌株80株,占67.23%;非北京基因型39株(32.77%),呈現(xiàn)出16個基因型(含8個新發(fā)現(xiàn)的基因型),具體包括H家族(含4株H和10株H3)14株(11.76%,14/119)、T家族(含8株T1、1株T2、4株T3和1株T5)14株(11.76%,14/119)、新發(fā)現(xiàn)的基因型8株(6.72%,8/119)、U基因型2株(1.68%,2/119)、Manu2基因型1株(0.84%,1/119)。非北京基因型以H3(25.64%,10/39)和T1(20.51%,8/39)比較常見。聚類結(jié)果顯示,19株為獨特類型,其余100株分為7簇,成簇率為84.03%(100/119),每簇含2株及以上,其中最大的一簇包含75株,菌株全部為ST1,即僅與SP35~SP43之間9個間隔區(qū)有陽性雜交信號,被稱為典型北京基因型。

    三、北京基因型與耐藥的關(guān)系

    80株北京基因型菌株有31株對PZA耐藥(38.75%),49株對PZA敏感(61.25%);39株非北京基因型菌株有13株對PZA耐藥(33.33%),26株對PZA敏感(66.67%)。北京基因型菌株對PZA的耐藥率與非北京基因型菌株對PZA的耐藥率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;北京基因型與非北京基因型菌株對Sm、EMB耐藥率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

    討 論

    MDR-TB化療方案的一線和二線藥物中PZA發(fā)揮獨特的作用,全面了解MDR-MTB菌株對PZA的耐藥水平,對MDR-TB患者進行合理治療具有非常重要的意義。由于PZA僅在酸性(pH 5.0左右)環(huán)境下才能發(fā)揮抗MTB的作用,而低pH值又抑制MTB的生長,實驗過程中如pH值輕微變動或接種量改變將引起最低抑菌濃度(MIC)的大幅度變化從而使得傳統(tǒng)培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上的PZA藥敏試驗結(jié)果可靠性比較差。為了更好指導(dǎo)臨床用藥,WHO推薦[10]應(yīng)用由美國BD公司研制生產(chǎn)的MGIT 960對PZA進行液體藥敏試驗檢測。該方法在美國、日本和歐洲等發(fā)達地區(qū)作為PZA藥敏試驗的標(biāo)準(zhǔn)方法。筆者應(yīng)用此法對福建省MDR-MTB菌株進行PZA耐藥性檢測,對PZA的耐藥率為36.97%,與上海的38.5%[14]和美國的38%[15]不相上下,低于北京市的57.7%[16]和重慶市的62.4%[17]。此結(jié)果提示,福建省MDR-TB患者應(yīng)用PZA進行化療時,應(yīng)考慮患者可能存在對PZA耐藥的問題。本次研究結(jié)果顯示,對Sm和EMB耐藥的MDR-MTB菌株對PZA的耐藥率均明顯高于對Sm、EMB敏感的菌株,表明MDR-MTB菌株對PZA耐藥與對Sm、EMB耐藥具有一定相關(guān)性。重慶市報道了MTB對PZA耐藥與對Sm耐藥具有一定相關(guān)性,而與對EMB耐藥無關(guān)[17]。也有文獻報道MTB對 PZA耐藥與對RFP耐藥和氧氟沙星(Oflx)耐藥具有相關(guān)性,也就是對RFP、Oflx耐藥的菌株對PZA的耐藥率也較高[18]。這可能是患者未經(jīng)藥敏試驗就聯(lián)合多種藥物治療所導(dǎo)致的[19]。先前福建省對涂陽肺結(jié)核患者對PZA耐藥的研究顯示,MDR-TB患者對PZA的耐藥率明顯高于非MDR-TB患者[20]。可見,臨床上為了確保MDR-TB患者使用合理的化療方案,先行對PZA進行耐藥性檢測顯得尤為重要。

    表1 福建省耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株耐藥情況與基因型分布的關(guān)系

    北京基因型MTB分布廣泛而備受全球關(guān)注,主要流行于東亞地區(qū)、中國、韓國和日本[21-22]。筆者采用Spoligotyping對MDR-MTB菌株進行分型,結(jié)果顯示北京基因型占67.23%,高于廣西壯族自治區(qū)的55.3%[23],低于浙江省的70%[24]和河北省的90.5%[25]。進一步體現(xiàn)了北京基因型分布具有地域性,說明了北京基因型是福建省的主要流行基因型。該基因型菌株流行速度快,傳播范圍廣,因此,今后工作中應(yīng)加強對北京基因型菌株的監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)其傳播規(guī)律,并對其生物學(xué)特征進行深入研究。

    本次研究結(jié)果顯示,MDR-MTB菌株非北京基因型占32.77%,呈現(xiàn)為高度的基因多態(tài)性,共16種基因型,以H家族和T家族多見。其中,H3和T1比較常見。據(jù)報道,H家族和T家族主要流行于非洲、歐洲和中、南美洲地區(qū)[12]。本次研究中H家族和T家族常見可能與福建省位于東南沿海,與全球各地經(jīng)濟貿(mào)易往來比較頻繁及日益發(fā)達的旅游業(yè)引起人口流動性較大有關(guān),再者也可能與福建省的氣候常年炎熱和潮濕有關(guān)。此結(jié)果提示,福建省結(jié)核病防治應(yīng)該加強對流動性人口結(jié)核病的管理和監(jiān)測。盡管H家族和T家族也流行于全球其他地區(qū),但是這兩個家族具有很高的遺傳異質(zhì)性,不像北京基因型家族基因高度保守,而且Spoligotyping指紋圖譜特征不明確。進一步表明了今后應(yīng)該探索其適宜的遺傳標(biāo)志物來加強對這2個家族的監(jiān)測,為全省結(jié)核病防治策略制定提供參考依據(jù)。

    盡管文獻報道北京基因型多次引起MDR-TB的暴發(fā),但是關(guān)于北京基因型與耐藥性之間的關(guān)系,我國各地研究結(jié)果不盡相同。有報道北京基因型與耐藥性無關(guān)[23-24],也有報道北京基因型與RFP耐藥、MDR和Oflx耐藥有關(guān)[26-27]。本研究顯示,北京基因型與非北京基因型對PZA耐藥率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其中,北京基因型與PZA耐藥性無關(guān)未見相關(guān)文獻報道。目前報道北京基因型與耐藥性的關(guān)系研究基本上就只是常規(guī)納入耐藥監(jiān)測的6種藥物RFP、INH、Sm、EMB、Oflx和卡那霉素進行分析[26-27]。因此,北京基因型菌株與耐藥表型之間的關(guān)系及其生物學(xué)特征還有待進一步研究。

    本研究也存在一定的缺陷,即采用菌株來源于2007—2008年和2010—2011年福建省耐藥監(jiān)測點,距今時限較久。但是當(dāng)時的監(jiān)測點多,覆蓋面廣,因此,收集到的菌株具有較好的代表性。

    志謝中國疾病預(yù)防控制中心傳染病控制所萬康林研究員、劉海燦博士對本研究進行了悉心指導(dǎo)和幫助。

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