羊棲菜褐藻糖膠的提取工藝優(yōu)化及理化性質(zhì)分析

劉 劍，楊亞彪，程 陽，王 妍，佟海濱，吳明江，張 旭

(溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江溫州 325035)

羊棲菜（Sargassum fusiforme）屬于褐藻門、褐藻綱、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬的一種海洋孢子植物，別名玉草、海草、六角菜、海大麥、鹿角尖等，從遼東半島到雷州半島均有分布，其中以浙江和福建沿海居多[1].羊棲菜是一種營養(yǎng)豐富的藥食兩用海藻，其干燥藻體全株入藥，稱為海藻.《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載羊棲菜味咸、性寒，歸肝、胃、腎經(jīng)，具有軟堅散結(jié)、消痰、清涼解毒、破血祛淤以及利水消腫等功效，用于緩解與治療癭瘤、瘰疬、睪丸腫痛、痰飲水腫等病癥.現(xiàn)代藥理研究表明多糖是羊棲菜的主要活性物質(zhì)，羊棲菜多糖的主要成分為褐藻糖膠（Fucoidan）、褐藻膠（Alginic acid）和褐藻淀粉（Laminaran）.大量研究證實羊棲菜多糖對治療腫瘤、心血管疾病、降低血糖、調(diào)節(jié)血壓、減輕氧化應(yīng)激損傷和延緩衰老等方面都有顯著效果[2-6]，而這些生物活性主要與褐藻糖膠密切相關(guān).同時，前期的研究發(fā)現(xiàn)羊棲菜褐藻糖膠可以活化Nrf2信號通路，上調(diào)抗氧化酶系的表達，緩解機體衰老進程[7].羊棲菜褐藻糖膠毒副作用小、安全性高，在保健品或藥物的開發(fā)利用方面具有十分重要的意義.

以往的研究多以多糖得率為指標，優(yōu)化多糖提取工藝[8-10]，然而，提取得率最高的工藝條件未必會制備出生物活性最佳的提取物.因此，有學者在經(jīng)典提取工藝評價指標的基礎(chǔ)上，加入提取物活性的評價指標來綜合評價提取工藝的優(yōu)劣，并通過正交試驗確定其最佳提取工藝[11-12].有學者報道了羊棲菜褐藻糖膠的提取工藝優(yōu)化[13-14]，但是有關(guān)結(jié)合清除自由基能力優(yōu)化羊棲菜褐藻糖膠的提取工藝尚未見報道.因此，本研究旨在優(yōu)選出得率較高并且抗氧化活性較好的羊棲菜褐藻糖膠提取工藝，為其深度開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 實驗部分

1.1 材料儀器

羊棲菜：由浙江省溫州市洞頭區(qū)羊棲菜養(yǎng)殖地提供.

DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），MACKLIN；三氟乙酸，ALADDIN；PMP，ACROS ORGANICS；D-葡萄糖醛酸，Sigma；右旋糖苷標樣，D-甘露糖，D-木糖，中國藥品生物制品鑒定所；L-鼠李糖，D-半乳糖醛酸，國藥集團化學試劑有限公司；D-葡萄糖，TCI；D-半乳糖，L-阿拉伯糖，L-巖藻糖等.

1525高效液相色譜儀，Waters科技有限公司；ODS-2HYPERSIL色譜柱，Thermo Scienfic；TSK gel G-3000PWXL-CP色譜柱，日本TOSOH公司；ICS-1000型離子色譜儀，戴安公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 羊棲菜褐藻糖膠的提取工藝

將羊棲菜粉碎回流脫脂，得脫脂藻粉.按照酸提（2 mol / L）[15]、水提、氯化鈣提（1%）[16-17]方法，以不同的液料比、提取時間、提取溫度進行提取，得到羊棲菜總多糖提取液，加入4 mol / L氯化鈣沉淀褐藻膠，經(jīng)離心、濃縮、透析后，向上清液中加入 4倍體積無水乙醇，4℃過夜后離心收集沉淀，經(jīng)真空冷凍干燥后得到羊棲菜褐藻糖膠（提取流程見圖1）.精確稱量后計算羊棲菜褐藻糖膠的得率.

圖1 羊棲菜褐藻糖膠提取工藝流程圖Fig 1 The Extraction Process Flow Diagram for Sargassum Fusiforme Fucoidan

1.2.2 羊棲菜褐藻糖膠清除DPPH自由基活性

參考文獻[18]，每支試管中加入0.1 mmol / L DPPH溶液1 mL，待測樣品溶液1 mL（濃度分別為：0、50、100、200、400、800、1 600 μg / mL），混勻后避光靜置30 min，在517 nm處測定吸光值A(chǔ)樣品.空白組為2 mL無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測其吸光值A(chǔ)空白.對照組為1 mL蒸餾水代替樣品溶液，測其吸光值A(chǔ)對照.根據(jù)以下公式計算樣品的DPPH自由基清除率.

1.2.3 單糖組成分析

參考文獻[19]，應(yīng)用PMP衍生化——高效液相色譜法分析樣品的單糖組成.

1.2.4 分子量測定

參考文獻[20]，應(yīng)用高效凝膠滲透色譜法測定樣品相對分子量.

1.2.5 紅外光譜分析

取少量干燥樣品，加入適量KBr粉末，并在紅外干燥箱中充分研磨，壓片，在500 – 4 000 cm-1范圍內(nèi)進行紅外掃描.

1.2.6 總糖、糖醛酸和蛋白含量測定

利用苯酚硫酸法[21]測定總糖含量，間羥基聯(lián)苯法[22]測定糖醛酸含量，考馬斯亮藍法[23]測定蛋白含量.

1.2.7 硫酸根含量測定

用離子色譜法測定硫酸根含量.稱取干燥的羊棲菜褐藻糖膠樣品3 mg，加3 mL鹽酸（1 mol / L）100℃水解3 h，氫氧化鈉中和后，選用Shodex IC-52 4E柱（4.0 mm × 250 mm），以4.5 mmol / L碳酸鈉和0.8 mmol / L碳酸氫鈉為流動相，流速為0.8 mL / min.

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗優(yōu)化具有DPPH清除能力的羊棲菜褐藻糖膠的提取工藝

多糖的提取率主要是與提取介質(zhì)、料液比、提取溫度、提取時間等因素相關(guān)[24-25].因此，設(shè)定正交實驗的因素水平，見表1.

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The Orthogonal Factor Level Table

按照L9(34)正交設(shè)計表的條件進行試驗，分別測定羊棲菜褐藻糖膠的得率和自由基清除率.綜合指標為各評價指標乘以權(quán)重系數(shù)相加所得（綜合指標 = 0.5 × 多糖得率 + 0.5 × 自由基清除率），結(jié)果見表2.由表2正交試驗結(jié)果可知，極差的結(jié)果為RA＞ RD＞ RC＞ RB，表明影響羊棲菜褐藻糖膠提取率的因素依次為 A ＞ D ＞ C＞ B.方差分析表明，4個因素中，A具有顯著影響（F =19.668，P＜0.05），其它因素的影響均不顯著，由此預(yù)測優(yōu)化后的最佳提取工藝為A1B1C3D1，即提取介質(zhì)為蒸餾水，液料比為20∶1，提取溫度為85℃，提取時間為1 h.

2.2 DPPH自由基的清除作用結(jié)果分析

正交試驗獲得的羊棲菜褐藻糖膠對DPPH自由基的清除作用見圖2.從圖2可看出，不同提取介質(zhì)制備的羊棲菜褐藻糖膠對DPPH自由基均有不同程度的清除作用，清除率隨著多糖濃度的增大而上升.水提羊棲菜褐藻糖膠的DPPH自由基清除能力較強，清除率達52.5% – 82.6%，而由鹽酸提取到的樣品清除率只有26.5% – 33.5%，提取介質(zhì)為氯化鈣所得樣品的清除率在60.9% –66.7%.以上表明提取介質(zhì)對褐藻糖膠的DPPH自由基清除能力影響較大，以鹽酸為介質(zhì)的提取過程中，褐藻糖膠中發(fā)揮抗氧化的活性基團和結(jié)構(gòu)可能被破壞，導致酸提樣品對DPPH自由基的清除能力最弱.

表2 正交試驗設(shè)計表及結(jié)果Table 2 The Orthogonal Test Design Table

2.3 驗證試驗

為驗證該工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，按優(yōu)化工藝條件進行了3次重復(fù)試驗，測定提取物中各指標性數(shù)據(jù)，并計算綜合評分.羊棲菜褐藻糖膠的平均得率為7.37%，DPPH的平均清除率為84.13%，其相對標準偏差為2.31%，實驗結(jié)果穩(wěn)定，表明優(yōu)化的羊棲菜褐藻糖膠提取工藝穩(wěn)定可行，結(jié)果見表4.

表3 工藝驗證試驗結(jié)果Table 3 The Verification Results of Process Certification

2.4 羊棲菜褐藻糖膠的理化性質(zhì)測定

經(jīng)過上述實驗的驗證后，通過優(yōu)化后的工藝條件提取獲得了具有較好自由基清除能力的羊棲菜褐藻糖膠，并對其基本理化性質(zhì)進行了測定分析.

2.4.1 分子量測定

羊棲菜褐藻糖膠的相對分子質(zhì)量通過高效凝膠排阻色譜法（HPGPC）進行測定.首先，利用不同分子量的葡聚糖標準品在HPGPC中的保留時間繪制標準曲線，求得回歸方程如圖3所示.利用標準曲線計算得到羊棲菜褐藻糖膠的分子量分布范圍在39.5 – 53.0 kDa和53.0 – 110.2 kDa，表明羊棲菜褐藻糖膠分子量分布較廣.

2.4.2 紅外光譜

如圖4，樣品在3 439 cm-1、2 926 cm-1和1 047 cm-1處有多糖的特征吸收峰，分別是O-H伸縮振動峰、C-H振動吸收峰、羧基的C-O伸縮振動峰.在1 509 cm-1附近有羰基非對稱伸縮振動、酰胺基N-H變角振動，表明含有糖醛酸，也可能存在與蛋白質(zhì)結(jié)合的褐藻糖膠；810 – 850 cm-1吸收峰是C-O-S伸縮振動，它的位置與硫酸根在糖殘基上的連接位置有關(guān)[26].羊棲菜褐藻糖膠在821 cm-1處有中等強度吸收峰，表明它們的硫酸根連接于糖殘基的C2或C3位；在1 250 cm-1處有較強的S=O對稱伸縮振動，表明羊棲菜褐藻糖膠中硫酸根含量較高.

圖2 不同提取條件下制備的羊棲菜褐藻糖膠對DPPH的清除作用Fig 2 The Scavenging Action of Sargassum Fusiforme Fucoidan to DPPH under the Different Exaction Conditions

2.4.3 基本理化性質(zhì)測定

羊棲菜褐藻糖膠的基本理化性質(zhì)見表4.由表4可知，羊棲菜褐藻糖膠的碳水化合物含量為80.3%，含有8.5%的糖醛酸，蛋白質(zhì)含量為1.3%，硫酸根含量為17.1%.已有大量文獻報道硫酸根基團與褐藻糖膠的許多重要生物活性密切相關(guān).

2.4.4 單糖組成

采用PMP柱前衍生HPLC法對羊棲菜褐藻糖膠的單糖組成進行分析，通過與9種單糖標準品色譜圖的出峰時間相比較（如圖5所示），確定各組分的單糖組成[19]，并結(jié)合樣品中各單糖的峰面積，計算得出各單糖的摩爾比例.如表5所示，羊棲菜多糖的單糖組成相對復(fù)雜，由7種單糖構(gòu)成，其中Fuc和Gal含量最多，分別為68.5%和17.5%，含Glc為5.4%，Man和Rha的含量都在3%左右，Xyl含量最低只有2.3%.

圖3 羊棲菜褐藻糖膠的高效凝膠排阻色譜圖Fig 3 The High Performance Size Exclusion Chromatography Diagram of Sargassum Fusiforme Fucoidan

圖4 羊棲菜褐藻糖膠的紅外光譜圖Fig 4 The Jnfra-red Spectrogram of Sargassum Fusiforme Fucoidan

圖5 PMP-柱前衍生液相色譜圖Fig 5 The Liquid Chromatogram of PMP Pre-column Derivatization

表4 羊棲菜褐藻糖膠的基本理化性質(zhì)Table 4 The Basic Physicochemical Properties of Sargassum Fusiforme Fucoidan

表5 單糖組成分析Table 5 The Monosaccharide Composition Analysis

3 結(jié) 論

正交試驗結(jié)果表明提取介質(zhì)對于羊棲菜褐藻糖膠的提取有顯著影響，綜合分析優(yōu)化得到提取羊棲菜褐藻糖膠的最優(yōu)方案為：20倍量蒸餾水提取，85℃提取3次，每次1 h，多糖的平均得率可達到7.37%，DPPH的平均清除率可達到84.13%.優(yōu)化后的工藝穩(wěn)定可靠，產(chǎn)物得率高且抗氧化活性好，可作為工業(yè)化大生產(chǎn)提取羊棲菜褐藻糖膠的工藝條件.本實驗優(yōu)選提取工藝時，采用多指標綜合加權(quán)評分法，避免了單一評價的片面性，使分析更加全面，從而使優(yōu)選出來的提取條件更加科學合理.

褐藻糖膠等生物大分子的活性往往由它的結(jié)構(gòu)決定，故分子量的大小、單糖組成、官能團等理化性質(zhì)的不同都能影響褐藻糖膠的生物活性.Kasai等[27]研究發(fā)現(xiàn)，低分子量、硫酸基團取代度較高的褐藻糖膠生物活性較好.羊棲菜褐藻糖膠的理化性質(zhì)和抗氧化活性因其提取介質(zhì)的不同而存在較大差異[16]，本實驗用蒸餾水提取的羊棲菜褐藻糖膠的糖含量、糖醛酸及硫酸根含量都相對較高，蛋白質(zhì)含量相對較低，對DPPH自由基的清除能力較強.羊棲菜多糖獨特的抗氧化和抗衰老作用，與其高效清除體內(nèi)自由基的能力密切相關(guān)[1-7].因而，優(yōu)化并建立具有良好抗氧化活性的羊棲菜褐藻糖膠的提取工藝，將成為充分利用并挖掘我國海洋藥物資源的有效途徑.