一株食源性傷寒沙門氏菌的多重耐藥性分析與小鼠致病性研究

趙 翔，劉 東，潘金金，袁 飛

（1.青島市市北區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東青島 266000；2.青島易邦生物工程有限公司，山東青島 266000）

沙門氏菌是最常見的引發(fā)食源性疾病的病原菌。人感染沙門氏菌后通常會(huì)導(dǎo)致腹瀉，此時(shí)可能需要借助藥物治療。目前臨床上用于治療的藥物通常為氟喹諾酮類和頭孢類。但隨著人類臨床治療和畜牧業(yè)生產(chǎn)中抗生素的廣泛使用和濫用，包括沙門氏菌在內(nèi)的很多病原菌都對(duì)其產(chǎn)生了多重耐藥。相關(guān)研究表明，沙門氏菌屬多重耐藥率在過去的20年內(nèi)從20%增加到了70%[1]。由于耐藥性可以通過食物鏈等形式在人畜間傳遞[2-3]，因此強(qiáng)化動(dòng)物用藥監(jiān)管迫在眉睫。本研究從山東省某肉鴨屠宰場中分離到一株傷寒沙門氏菌，并對(duì)該菌株的耐藥性和對(duì)小鼠的致病性進(jìn)行了檢測分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、麥康凱瓊脂和生化發(fā)酵管：均購自杭州微生物試劑有限公司；沙門氏菌診斷血清：購自成都生物制品研究所；Taq DNA聚合酶、dNTP、100 bp DNA Marker和PCR產(chǎn)物回收試劑盒：購自TransGene公司。

1.2 菌株來源

試驗(yàn)用傷寒沙門氏菌：由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.3 藥敏性試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。挑取單個(gè)菌落接種于4 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，用無菌PBS緩沖液稀釋菌液，使其在600 nm波長吸光度為0.1；將稀釋后的菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基表面，每塊培養(yǎng)基貼5個(gè)紙片，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后量取抑菌圈直徑，重復(fù)3次計(jì)平均值，同時(shí)以大腸桿菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株。參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）藥敏結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)（2013版）[4]進(jìn)行結(jié)果判定。

1.4 分離株耐藥基因PCR檢測

1.4.1 沙門氏菌DNA提取 采用煮沸法制備沙門氏菌DNA模板[5]。

1.4.2 引物 根據(jù)GenBank收錄的沙門氏菌耐藥基相關(guān)序列及文獻(xiàn)報(bào)道[6-9]合成23對(duì)引物（表1），分別擴(kuò)增氟喹諾酮類耐藥相關(guān)基因：gyrA、gyrB、parC、parE；I類整合子：Integron I；四環(huán)素類耐藥基因：tetA（A）、tetA（B）、tetA（C）、tetA（G）；磺胺類耐藥基因：Sul I、Sul II；氯霉素類耐藥基因：cml A、CatI、floR；氨基糖苷類耐藥基因：aadA1、StrA-B、aac（3）- Ⅳ、aph（3）-Ia；甲氧芐氨嘧啶的耐藥基因：dfr12；β-內(nèi)酰 胺 類 耐 藥 基 因：blaTEM-1、blaPSE-1、blaCMY-2、blaCMY-9。引物由上海華大基因合成。

1.4.3 PCR擴(kuò)增和測序 氟喹諾酮類耐藥基因和Ⅰ類整合子PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃45 s，54～59 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min；退火溫度使用各引物合成時(shí)的Tm值減3～5 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對(duì)陽性樣品用Axygen公司膠回收試劑盒回收后，送至大連寶生物進(jìn)行DNA 測序。其他耐藥基因PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min，94 ℃ 45 s、55～60 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min；退火溫度使用各引物合成時(shí)的Tm值減3～5 ℃。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.4.4 耐藥基因分析 用BLAST軟件將測序的gyrA、gyrB、parC、parE和IntegronⅠ基因與Genbank中參考株Salmonella Typhimurium LT2用MegAlign軟件進(jìn)行對(duì)比，分析其突變位點(diǎn)和種類，以及整合子基因所含的氟喹諾酮類耐藥基因。其他耐藥基因由PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽性。

表1 沙門氏菌耐藥基因PCR引物

1.5 小鼠致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)用清潔級(jí)Balb/c小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。6只小鼠隨機(jī)分成2組，每組3只；一組為空白對(duì)照組，每只腹腔注射生理鹽水0.2 mL；另一組為試驗(yàn)組，每只腹腔注射菌液0.2 mL/只（0.8×108CFU/只）。每隔8 h觀察1次，連續(xù)觀察4 d。記錄試驗(yàn)動(dòng)物的發(fā)病和死亡情況，剖檢死亡小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株K-B法藥敏性試驗(yàn)

紙片藥敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究分離株對(duì)9大類20種抗菌藥中的16種產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性，對(duì)亞胺培南、丁胺卡那和洛美沙星中度敏感，僅對(duì)合成類的磷霉素高度敏感藥（表2）。

表2 20種抗生素藥敏性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 分離株耐藥基因PCR檢測

2.2.1 四環(huán)素類類、磺胺類、氯霉素類、氨基糖苷類、甲氧芐氨嘧啶及β-內(nèi)酰胺類的耐藥基因PCR檢測 PCR檢測發(fā)現(xiàn)，該分離菌株的18種耐藥基因檢測全為陽性（表3、圖1、圖2）。

圖1 分離株部分耐藥基因PCR電泳

圖2 分離株部分耐藥基因PCR電泳

表3 分離株部分耐藥基因PCR檢測結(jié)果

2.2.2 氟喹諾酮類耐藥基因和I類整合子基因序列分析 經(jīng)序列分析，分離株與氟喹諾酮類抗生素耐藥相關(guān)的gyrB基因未檢出突變，gyrA、parC和parE基因共檢出5個(gè)點(diǎn)突變，分別為gyrA基因的Ser83Phe、Asp87Asn；parC基因的Ser80Arg；parE基因的Lys441Ile、Asp494Asn。分離株具有1.6 kb大小的整合子，并攜帶aadA5（鏈霉素耐藥基因）和drf17基因（甲氧芐氨嘧啶耐藥基因）。

2.3 小鼠致病性試驗(yàn)

觀察接種菌液后的小鼠，3只小鼠于接種后1 d，陸續(xù)出現(xiàn)精神萎頓、嚴(yán)重腹瀉、被毛松亂等癥狀，3 d內(nèi)全部死亡；生理鹽水對(duì)照組小鼠正常。剖檢發(fā)病死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)肝表面有灰白色、針尖大小壞死點(diǎn)，脾臟腫大。無菌條件下采集病死小鼠肝臟，分離培養(yǎng)肝臟中的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為與分離株同源的傷寒沙門氏菌。

3 討論

導(dǎo)致家禽感染的沙門氏菌有很多種，主要有雞白痢、鼠傷寒、禽副傷寒、腸炎沙門氏菌等。從齊靜等[10]、劉敏芳等[11]、陳俊等[12]分別對(duì)山東、廣東、四川、重慶等地發(fā)病鴨中分離到的沙門氏菌分析看，這些菌株血清型多樣，且對(duì)鴨的致病力和多重耐藥性都很強(qiáng)。但從現(xiàn)有的分析看，傷寒沙門氏菌分離率較低。這與吳荔琴等[13]、鐘舒紅等[14]、王曉泉等[9]、侯雪嬌等[15]，分別對(duì)廣東、廣西、江蘇、山東等地屠宰場、超市、自由市場分離的沙門氏菌分析后得出的結(jié)論相同。從彭峻烽等[16]對(duì)成都地區(qū)鴨屠宰場沙門氏菌分離的結(jié)果看，傷寒沙門氏菌只在宰前和屠宰環(huán)節(jié)有檢出，且檢出率較其他血清型低很多。故傷寒沙門氏菌并不是養(yǎng)殖和食源檢測中的優(yōu)勢(shì)流行菌型。然而不能因此忽視傷寒沙門氏菌的危害。因?yàn)槭紫人且鹑思毙允澄镏卸竞臀改c炎的罪魁禍?zhǔn)?，其次它同印第安納沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和副傷寒沙門氏菌一樣，多重耐藥性最強(qiáng)[16-17]。因此，無論傷寒沙門氏菌污染處于哪一環(huán)節(jié)，都要引起獸醫(yī)和公共衛(wèi)生部門的高度重視。

沙門氏菌耐藥日趨成為世界范圍內(nèi)關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。有研究表明，沙門氏菌耐藥性在過去20年內(nèi)，從20%上升到70%，甚至更多，其對(duì)氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類等常用抗生素多重耐藥的演變速度遠(yuǎn)超人們想象[1，18-20]。從我國近年來對(duì)沙門氏菌多重耐藥的研究分析看，其分離概率也呈現(xiàn)增加的態(tài)勢(shì)，并且多重耐藥譜越來越寬[3，6，9-16]。本研究所用藥敏試紙片抗生素類型是人醫(yī)和獸醫(yī)臨床上經(jīng)常使用的品種，其中也不乏一些新一代抗生素，但藥敏試驗(yàn)結(jié)果并不理想。分離株耐藥性極強(qiáng)，所測19種抗生素種只有磷霉素這一種合成類抗生素對(duì)其高敏感，并且抑菌圈直徑也不夠大；PCR

對(duì)耐藥基因檢測和序列分析的結(jié)果與耐藥表型檢測結(jié)果基本一致。目前并未見傷寒沙門氏菌有如此嚴(yán)重耐藥的報(bào)道。這一方面跟獸醫(yī)和人醫(yī)臨床用藥泛濫直接相關(guān)，另一方面也可能跟分離株的偶然性有關(guān)。小鼠致病性試驗(yàn)也驗(yàn)證了分離株對(duì)哺乳動(dòng)物的致病力。現(xiàn)有研究雖然不能證明致病力與耐藥基因之間存在必然的因果關(guān)系，但多重耐藥性的增強(qiáng)勢(shì)必會(huì)減少臨床用藥的選擇和降低用藥效果，這就給公眾敲響了警鐘，一旦此類耐藥菌廣泛流行將對(duì)公共衛(wèi)生造成極大影響。