市售豬肉中沙門(mén)氏菌耐藥基因與毒力基因篩查及PFGE分型研究

黃秀梅，蓋文燕，曲志娜，趙思俊，李月華，王玉東，王君瑋，王 娟

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

沙門(mén)氏菌作為一種重要的人獸共患病條件性致病菌，可感染人和動(dòng)物，引起多種疾病，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[1]。沙門(mén)氏菌感染人后，最常表現(xiàn)為胃腸炎，易引起惡心、嘔吐、腹痛等癥狀，過(guò)量時(shí)可造成食物中毒，危及人的生命安全[2]。動(dòng)物產(chǎn)品中的沙門(mén)氏菌污染是導(dǎo)致人類食物中毒的重要因素。沙門(mén)氏菌的致病機(jī)制多樣，致病性強(qiáng)弱與其毒力因子表達(dá)密切相關(guān)[3]。沙門(mén)氏菌一直以來(lái)都是食源性疾病監(jiān)測(cè)中的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，而細(xì)菌耐藥菌株也成為國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)越來(lái)越關(guān)注的內(nèi)容。了解并掌握市售豬肉中沙門(mén)氏菌耐藥基因、毒力基因攜帶狀況，并利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行分子分型研究，是降低豬肉產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌污染的重要途徑，其在沙門(mén)氏菌流行病調(diào)查和溯源工作中發(fā)揮著重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 2017年從山東省青島市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)市售豬肉中分離的22株沙門(mén)氏菌菌株；耐藥性質(zhì)控菌株（ATCC25922），PFGE分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)菌株（沙門(mén)氏菌Braenderup H9812），為中國(guó)疾病控制中心傳染病所PulseNet實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱（SLI-700，日本東京理化），水浴搖床（TS-211，上海天呈科技），渦旋振蕩器（WH-2，上海滬西分析儀器廠），可見(jiàn)分光光度計(jì)（722N，上海精密科學(xué)儀器有限公司），PCR儀（TC-S/96，杭州博日科技），CHEF-mapper型脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、GEL DOCXR凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），VITEK濁度儀（法國(guó)BioMerieux公司）。

1.1.3 主要試劑 SeaKem Gold瓊脂糖（美國(guó)BD公司），腦心浸液培養(yǎng)基、細(xì)菌瓊脂粉（北京陸橋技術(shù)有限公司），耐藥性檢測(cè)板（上海星佰生物技術(shù)有限公司），限制性內(nèi)切酶Xba I（大連TaKaRa公司），引物合成以及蛋白酶K、其他分析純?cè)噭ㄉ虾Ｉど锕煞萦邢薰荆?/p>

1.2 方法

1.2.1 耐藥性測(cè)定 按照國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法（MIC法），測(cè)定分離菌株最小抑菌濃度；參 照 CLSI文 件 VET01-S2（2013） 和 M100-S24（2014）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.2 耐藥基因檢測(cè) 根據(jù)GenBank中的基因序列，并參照文獻(xiàn)[4-7]，設(shè)計(jì)沙門(mén)氏菌6類藥物10對(duì)耐藥基因擴(kuò)增引物：β-內(nèi)酰胺類藥物blatem-1、blacmy-2基因，四環(huán)素類藥物tetA基因，氨基糖苷類藥物aadA1、aadA2基因，氟喹諾酮類藥物qnr 基因，磺胺類藥物sulⅠ、sulⅡ、sul Ⅲ基因，氯霉素類藥物CmlA基因。上海生工生物工程有限公司合成耐藥基因引物（表1）。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀上觀察、拍照保存結(jié)果。

表1 10對(duì)耐藥基因引物序列

1.2.3 毒力基因檢測(cè) 按照文獻(xiàn)[8-11]發(fā)表的沙門(mén) 氏 菌 mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB、spvA、spvB、spvC、spvD、spvR、hisJ、fliC、stn、fimA毒力基因序列，設(shè)計(jì)合成14對(duì)沙門(mén)氏菌毒力基因擴(kuò)增引物（表2）。PCR反應(yīng)體系為25 μL： Go Taq? Green Master12.5 μL，模板 DNA 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，去離子水9.5 μL。5種毒力島核心蛋白基因mogA、sseL、mgtC、bcfA、araB的反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存；5種毒力質(zhì)?；騭pvA、spvB、spvC、spvD、spvR的反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存；其余4種毒力因子基因hisJ、fliC、stn、fimA的反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，Tm退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。每個(gè)樣品取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用DL2000 DNA Marker 作為參照，140 V恒壓電泳30 min；電泳結(jié)束后用凝膠成像儀進(jìn)行成像分析，記錄結(jié)果。

表2 毒力基因引物序列

1.2.4 PFGE分型 根據(jù)PulseNet China技術(shù)手冊(cè)中PFGE操作規(guī)范，采用Xba I限制性內(nèi)切酶對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行酶切；將試驗(yàn)獲取的電泳圖譜，用BioNumerics v4.0數(shù)據(jù)庫(kù)軟件進(jìn)行處理，識(shí)別圖形條帶。對(duì)聚類圖和矩陣圖，使用非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法（UPGMA）構(gòu)建，條帶位置差異容許度選擇1.0%，優(yōu)化值為0.5%，用Band based/Dice系數(shù)來(lái)衡量PFGE帶型之間的相似度，范圍在0～1之間（0表示完全不相關(guān)，1表示完全相同）。在限制性內(nèi)切酶的作用下，不同菌株會(huì)呈現(xiàn)不同條帶數(shù)和不同大小片段，按照PulseNet的命名原則，對(duì)每種不同的帶型進(jìn)行命名。

2 結(jié)果

2.1 菌株耐藥性和耐藥基因攜帶情況

2.1.1 分離菌株耐藥情況 通過(guò)測(cè)定分離菌株對(duì)7類12種抗菌藥物的最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)分離菌株對(duì)氨芐西林耐藥最嚴(yán)重，耐藥率為72.73%；其次是對(duì)氟苯尼考，耐藥率為68.18%。其中，對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物中的氨芐西林、奧格門(mén)丁耐藥率相差較大，耐藥率分別為72.73%、36.36%，對(duì)其余同類藥物的耐藥率相差不大（表3）。對(duì)22株沙門(mén)氏菌進(jìn)行10種耐藥基因檢測(cè)，共測(cè)出9種耐藥基因。其中：攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（blatem-1）的菌株最多，占72.73%（16/22）；其次是攜帶四環(huán)素耐藥基因（tetA）的菌株，占36.36%（8/22），攜帶氨基糖苷類耐藥基因（aadA2/ aadA1）菌株分別占31.82%（7/22）和22.73%（5/22）；攜帶磺胺類耐藥基因（sulⅡ/ sulⅠ/ sulⅢ）的菌株較少，分別占27.27%（6/22）、13.64%（3/22）和13.64%（3/22）。檢測(cè)到的耐藥基因與耐藥表型符合率達(dá)95%（圖1和圖2）。

表3 22株分離沙門(mén)氏菌對(duì)12種藥物的耐藥性結(jié)果

圖1 耐藥基因電泳結(jié)果

圖2 22株豬源沙門(mén)氏菌攜帶耐藥基因結(jié)果

2.2 試驗(yàn)菌株毒力基因攜帶情況

對(duì)22株沙門(mén)氏菌進(jìn)行14種毒力基因檢測(cè)，結(jié)果共檢出13種毒力因子。所有分離菌株均攜帶mgtC、bcfA毒力基因，而mogA、araB、stn、fimA基因攜帶率均為95.45%，sseL基因攜帶率為68.18%，hisJ基因攜帶率為45.45%。來(lái)自不同地區(qū)的同種血清型沙門(mén)氏菌所攜帶的毒力基因有所不同，某些來(lái)自同一地區(qū)不同血清型沙門(mén)氏菌攜帶的毒力基因基本相同（圖3和圖4）。

2.3 PFGE分型結(jié)果

對(duì)22株沙門(mén)氏菌通過(guò)沙門(mén)氏菌血清型試劑盒進(jìn)行血清型鑒定，共檢測(cè)出12種血清型，其中腸炎沙門(mén)氏菌和印第安納沙門(mén)氏菌為優(yōu)勢(shì)血清型。

22株沙門(mén)氏菌脈沖場(chǎng)電泳結(jié)果顯示（圖5）：22株沙門(mén)氏菌共分為8個(gè)群，包括8個(gè)不同的帶型，菌株相似度為60%～100%。PFGE指紋圖譜與血清型具有一定的相關(guān)性，相同血清型的菌株聚類后，都能分到同一群。本研究獲得的7株鼠傷寒沙門(mén)氏菌有3個(gè)帶型，依次為01、02、08；6株德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌有4個(gè)帶型，依次為01、04、05、08；4株腸炎沙門(mén)氏菌有3個(gè)帶型，依次為03、06、08。

圖3 22株豬源沙門(mén)氏菌毒力基因電泳結(jié)果

圖4 22株豬源沙門(mén)氏菌攜帶毒力基因結(jié)果

從檢測(cè)結(jié)果看，來(lái)自不同區(qū)域的德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、湯普遜沙門(mén)氏菌攜帶的毒力基因基本一致，而其他血清型的分離菌株所攜帶的毒力基因差別較大；來(lái)自4個(gè)不同區(qū)域的腸炎沙門(mén)氏菌攜帶的毒力基因情況分為兩種。

3 討論

3.1 耐藥性和耐藥基因

圖5 22株沙門(mén)氏菌PFGE分型結(jié)果

分離菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率為36.36%～72.73%，對(duì)四環(huán)素耐藥率為40.91%，對(duì)氨基糖甙類藥物的耐藥率為22.73%～36.36%，對(duì)磺胺類藥物的耐藥率為27.27%～31.82%。16株沙門(mén)氏菌均檢測(cè)出blatem-1基因，檢出率為72.73%，遠(yuǎn)高于劉芳萍等[12]從雞源中的檢出率（31.00%），這提示應(yīng)該注意β-內(nèi)酰胺類藥物的合理用藥，防止耐藥性增強(qiáng)及多重耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，進(jìn)而影響人們身體健康。

四環(huán)素類藥物的tetA耐藥基因檢出率為36.36%，稍低于劉芳萍等[12]和Yang等[13]的報(bào)道；對(duì)于氨基糖苷類藥物的aadA1和aadA2基因，檢出率分別為22.73%和31.82%，低于Ahmed等[14]的檢出率；對(duì)于磺胺類藥物的3種耐藥基因sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ均有檢出，且檢出率為13.64%～27.27%。而鄒明等[4]發(fā)現(xiàn) sulⅠ的檢出率較低，而sulⅡ、sulⅢ的檢出率較高，說(shuō)明可能存在某些措施可以降低沙門(mén)氏菌污染。

3.2 毒力基因

對(duì)22株試驗(yàn)菌株進(jìn)行沙門(mén)氏菌14對(duì)毒力基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除毒力質(zhì)?；騭pvB未被檢出外，其余毒力基因均有檢出。其中，毒力島SPI3和SPI4的核心蛋白mgtC、bcfA基因檢出率均為100%；腸毒素stn基因及毒力島SPI1、SPI5核心蛋白基因mogA、araB檢出率均為95.45%。該檢出率與雞蛋中沙門(mén)氏菌這5種毒力基因的檢出率大致相同[15]，同時(shí)也有研究表明，雞源沙門(mén)氏菌中這5種毒力基因幾乎100%檢出，這表明豬源與雞源沙門(mén)氏菌可能都具有較強(qiáng)的毒力，需進(jìn)一步研究其致病性是否一致，深入了解其作用機(jī)制。

本研究中所鑒定出的德?tīng)柋吧抽T(mén)氏菌均攜帶stn、fimA、mogA、mgtC以及bcfA基因；所有攜帶毒力質(zhì)?；蛏抽T(mén)氏菌分離株血清型均為腸炎沙門(mén)氏菌，且腸炎沙門(mén)氏菌均檢測(cè)到5種毒力島基因；鼠傷寒沙門(mén)氏菌中80%均攜帶hisJ基因，需大量試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)鼠傷寒沙門(mén)氏菌與hisJ毒力基因是否具有一定的聯(lián)系。湯普遜沙門(mén)氏菌血清型均檢測(cè)出stn、fimA基因以及5種毒力島基因，另外未檢測(cè)到毒力質(zhì)粒基因，也未檢測(cè)到hisJ以及fliC基因，同時(shí)同試驗(yàn)者在關(guān)于雞源沙門(mén)氏菌毒力基因的檢測(cè)研究中，也未檢測(cè)到這兩種毒力基因，因而需進(jìn)一步研究其攜帶狀況與沙門(mén)氏菌血清型的關(guān)系。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其他血清型沙門(mén)氏菌菌株毒力基因檢出情況沒(méi)有一定的規(guī)律性，需進(jìn)一步深入研究。

3.3 PFGE分型

本試驗(yàn)對(duì)青島市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)市售豬肉中分離的沙門(mén)氏菌進(jìn)行PFGE分子分型，發(fā)現(xiàn)相同血清型菌株基本可以分到同一群，這與先前的報(bào)道[16]一致。同一血清型，根據(jù)不同的遺傳背景，可以分成不同的帶型，說(shuō)明該方法可以在沙門(mén)氏菌表型分型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析其差別，從而在沙門(mén)氏菌食源性疾病的暴發(fā)調(diào)查及監(jiān)測(cè)中發(fā)揮作用。此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢(shì)血清型較明顯，這可能與樣品的來(lái)源有關(guān)。

條帶間相似度差異較小，都在80%左右，且部分菌株條帶差異基本為2～3條。按照Tenover等[17]的觀點(diǎn)，菌株間存在2～3條差異（高度相關(guān)），可能是由酶切位點(diǎn)的點(diǎn)突變、缺失或者插入引起的。但是Barrett等[18]對(duì)于2～3條帶差異的解釋，一種可能是由于沙門(mén)氏菌基因組中質(zhì)粒的穩(wěn)定性導(dǎo)致的，另一種情況認(rèn)為由點(diǎn)突變或插入導(dǎo)致的條帶太小，跑出了膠外。所以，對(duì)于條帶相同或高度相似的菌株還應(yīng)該結(jié)合流行病學(xué)資料進(jìn)行分析。

4 結(jié)論

本研究對(duì)青島市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)市售豬肉中分離的沙門(mén)氏菌耐藥性及攜帶的耐藥基因、毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行分子分型，發(fā)現(xiàn)市售豬肉中的沙門(mén)氏菌以腸炎沙門(mén)氏菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌兩種血清型居多，占分離菌株的50%，這兩種血清型對(duì)公共衛(wèi)生具有潛在威脅；分離菌株對(duì)氨芐西林和氟苯尼考的耐藥率分別高達(dá)72.73%和68.18%，并攜帶多種耐藥基因和毒力基因。這對(duì)消費(fèi)者健康構(gòu)成了威脅，須對(duì)豬肉產(chǎn)品生產(chǎn)、加工及銷(xiāo)售過(guò)程中的環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格控制，防止環(huán)境中的沙門(mén)氏菌對(duì)豬肉產(chǎn)品污染以及產(chǎn)品中的沙門(mén)氏菌交叉污染。