水稻黃綠葉突變體研究進展

李素貞 楊文竹 陳茹梅

（中國農業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081）

植物葉綠素合成是一個非常復雜的過程。葉綠素的合成從谷氨酰-tRNA開始，共經過16個步驟，由20多個基因編碼的16種酶完成［1］。該途徑中任何一個基因發(fā)生突變都有可能影響葉綠素的合成，從而改變葉綠體中各種色素的含量與比例，引起葉片顏色的變化。水稻葉色突變體的類型非常豐富。目前，在水稻中已經發(fā)現白化、黃葉、淡綠、常綠、深綠、條紋和斑馬紋等葉色突變體160多種，已開展研究的有134個基因。它們分布在相應的染色體上，其中124個基因有緊密連鎖的分子標記，已有35個基因被克隆［2］。這些基因主要參與葉綠體的分化與發(fā)育、葉綠素的合成與分解等。在基礎研究中，葉色突變體是研究植物光合作用和光形態(tài)建成［3-4］、激素生理以及抗病機制［5-6］等一系列生理代謝過程的理想材料；在育種工作中，葉色可作為標記性狀，用于良種繁育和雜交育種［7-8］；某些葉色突變體具有特殊的優(yōu)良性狀，可作為良好的種質資源［9］。此外，利用此種突變體可分析鑒定基因功能［10］，了解基因間互作等［11］；用葉色突變體還可培育觀賞植物［12］。本文綜述了水稻黃綠葉（Yellow green leaf，YGL）突變體的研究現狀，旨為進一步探討YGL基因的功能及其應用潛力奠定基礎。

1 水稻黃綠葉突變體

ygl1突變體是以水稻栽培品種鎮(zhèn)恢24為背景的材料，該突變體與野生型相比在幼葉中葉綠素含量降低，但是葉片中四吡咯中間體含量增加，從而延遲了葉綠體的發(fā)育。遺傳學分析表明，ygl1的表型是由隱性核基因控制的。YGL1基因定位在第5染色體上，序列分析顯示在水稻基因組中YGL1基因有一個拷貝，其編碼葉綠素合成酶，催化葉綠素酸酯植醇化，生成葉綠素a。YGL1基因的突變導致葉綠體類囊體膜和基粒片層垛疊數減少，且基粒排列不規(guī)則。在產量方面，雖然ygl1突變體植株生長量和單穗重均低于野生型，但由于其成穗率升高，所以YGL1基因的突變對產量無影響。然而，編碼葉綠素a/b結合蛋白的cab1R基因mRNA的表達量在ygl1突變體幼苗中被嚴重的抑制。并且，與葉綠素合成及葉綠體發(fā)育相關的核基因表達量嚴重受到影響。這些結果表明，編碼各種葉綠體蛋白的核基因受到葉綠素或者葉綠素前體水平的反饋調節(jié)［13］。

陳紅等［14］在Co60輻射的群體中分離到y(tǒng)gl2的突變體，正常生長條件下，ygl2突變體表現為黃綠葉，并且葉綠素和四吡咯中間體含量降低。然而，葉綠素a與葉綠素b的比率增加，最終導致葉綠體發(fā)育不發(fā)達。YGL2基因定位于第6染色體，序列分析顯示YGL2編碼水稻的血紅素加氧酶，并且用轉基因互補及RNA干擾實驗證實了該功能。YGL2在水稻各組織中均有表達，而在葉片中高表達并且受溫度調節(jié)。在YGL2/HO1（Heme oxygenase 1）基因的第一個外顯子處有一個7 kb的插入，導致YGL2在ygl2突變體中的表達量顯著降低。此外，與葉綠素光合作用相關基因的表達水平在ygl2突變體中也發(fā)生了變化。這些結果表明，YGL2在葉綠素合成過程中有重要的作用［14］。

ygl3是以水稻恢復系縉恢10號為背景的黃綠葉突變體，其葉片在整個生育期均表現為黃綠色，且葉鞘也表現為黃色。ygl3突變體能正常結實，但有效穗和主穗重與野生型相比分別降低43%和30%。突變體苗期的葉綠體基粒類囊呈現空的片層狀，且排列不規(guī)則。ygl3突變體的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量較野生型均降低，且突變體的超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）酶活性也顯著升高。雜交實驗證明該黃葉性狀由一對隱性核基因控制。YGL3定位于第3染色體長臂末端，鎂離子螯合酶D亞基（Magnesium-chelatase subunit ChlD）與該突變性狀高度相關，但有待進一步研究［15］。

劉夢夢等［16］通過甲基磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate，EMS）誘變獲得了ygl4的黃綠葉突變體，其葉片在整個生育過程中均表現為黃綠色，葉綠素總含量較野生型降低，僅為對照的38.2%-50.5%。ygl4突變體的主穗長、主穗實粒數、一次枝梗數、結實率、千粒重與野生型相比無顯著性差異，而有效穗和株高均顯著下降。遺傳分析表明該性狀受1對隱性核基因控制。微衛(wèi)星標記證明YGL4定位于第10染色體上，進一步研究將該基因定位于RM1162和RM7093之間，分別距其1.8 cM和4.0 cM。該研究為YGL4基因的圖位克隆和分子標記輔助選擇育種奠定了基礎。

ygl6是以縉恢為背景通過EMS誘變產生的黃綠葉突變體，其幼苗期葉片表現為黃綠色，而在拔節(jié)期葉片為淡綠色。ygl6突變體中葉綠素a、葉綠素b，以及類胡蘿卜素的含量在苗期和抽穗期均比野生型低，突變體葉肉細胞的超微結構與野生型無明顯差異。而突變體葉綠體的類囊體發(fā)育不發(fā)達，并且基粒疊加也減少。遺傳學分析表明ygl6突變體是受隱性單基因控制的。YGL6位于第12染色體的著絲粒處。RNA干擾YGL6基因的表達實驗證明Os12g23180是候選基因［17］，以上關于YGL6基因的研究結果對于我們理解葉綠體的發(fā)育機制有重要作用。

ygl7是一個自然的葉片黃綠色突變體，其葉片在水稻的整個生育周期均表現為黃綠色，而不會影響水稻的農藝性狀和產量性狀。YGL7編碼鎂螯合酶的ChlD亞基，位于第3染色體長臂上。YGL7突變后葉片顏色由綠變黃，而RNAi介導的YGL7的沉默會導致轉基因植物致死。這表明YGL7在水稻生長發(fā)育過程中有重要作用。而ygl7突變體的光合色素較野生型降低，但其光合效率略有升高，表明YGL7的突變沒有導致其功能的喪失，反而具有另一種新的功能。說明YGL7蛋白既有螯合酶D亞基的功能，也可能具有上調與光合作用相關基因表達的功能，從而提高水稻的光合效率。Chl1、YGL98、YGL3與OsChlD是等位基因，等位基因突變體與ygl7的雜交實驗表明它們雜交后代也表現黃綠葉片。ygl7近等基因系的葉色為黃色而非黃綠色，ygl7回交后代的葉色也為黃色。以上結果表明ygl7突變體是一個理想的葉色標記，ygl7組合的雜交后代葉色呈更明顯的黃色，可作為培育優(yōu)良不育系的葉色標記，更方便快捷地服務于雜交制種提純工作［18-19］。

ygl8是通過EMS誘變得到的突變體，該突變體整個生育期植株的葉綠素a、b及總葉綠素含量均低于野生型，然而葉綠素a與b的比例沒有明顯變化。ygl8突變體的葉綠體片層膨脹，并且雜亂無章。葉片的氣孔導度、胞間二氧化碳濃度、光合速率、蒸騰速率均低于野生型。說明YGL8基因的突變對于葉綠體的發(fā)育以及葉片執(zhí)行的功能有重要的影響。YGL8主要在葉片中表達，定位于第1染色體上。YGL8編碼葉綠體定位的尿苷酸激酶，在水稻的葉色調解中起重要作用?；パa實驗能夠恢復ygl8突變體的表型，并且RNA干擾YGL8植株表現為黃綠葉片。光合體系質體基因組編碼的PsaA、PsaB、PsbC和核基因組編碼的HEMC、HEME、PORA的表達量在ygl8突變體中均降低［20］。因此，YGL8可能通過調解質體基因組編碼的類囊體膜組成基因的表達影響葉綠體基質片層，間接影響葉綠素的生物合成。

用EMS處理的縉恢10號誘變群體中發(fā)現ygl9黃綠色葉片突變體，其抽穗期葉片漸變?yōu)榈G色。ygl9突變體苗期、分蘗期和抽穗期光合色素與野生型相比均顯著降低，而在抽穗期氣孔長度、氣孔導度和蒸騰速率比野生型顯著增加，凈光合速率無明顯變化。透射電鏡觀察發(fā)現ygl9突變體的葉綠體結構基本完整，而嗜鋨小體增多、基粒模糊、基質片層減少且疏松。遺傳分析表明該突變性狀受1對隱性核基因控制。YGL9定位在第3染色體短臂上。推測可能編碼葉綠體信號識別顆粒cpSRP43。YGL9蛋白定位至葉綠體，主要在葉鞘及葉片中表達，并且該基因的表達與色素的代謝相關。此外，葉綠體的發(fā)育及植株的光合作用在突變體中均受到影響［21-22］。以上結果表明，YGL9可能參與水稻色素的代謝、葉綠體的發(fā)育及光合作用。

ygl10是以秈稻93-11為背景的黃綠葉突變體，其株高、穗長、結實率與野生型相比均有下降。突變體中葉綠素a、b及類胡蘿卜素含量也比野生型低，其中葉綠素b的含量下降比較顯著，僅為野生型的2%。葉綠體超微結構表明，ygl10突變體中類囊體和基粒片層數量比野生型顯著減少。遺傳分析表明，該突變性狀由1對隱性核基因控制。分子標記將YGL10定位在水稻第10染色體。序列分析發(fā)現該基因編碼葉綠素a氧化酶（Chlorophyll a oxygenase），基因（OsCAO1）的第9個外顯子處存在5個堿基的缺失。因此，OsCAO1為可能的候選基因［23］。

突變體ygl13的葉片在整個生育期均表現為黃綠色，其苗期和孕穗期葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量較野生型均顯著降低。透射電鏡結果顯示，突變體ygl13葉綠體結構異常，類囊體片層減少，基質片層減少退化，分布不規(guī)則。突變體ygl13與野生型相比穗總粒數增加，但結實率和株高均降低。而有效穗、穗長、穗實粒數和千粒重與野生型無顯著差異。F2群體分離比表明，ygl13的黃綠葉性狀由一對隱性核基因控制。YGL13定位于第8染色體短臂上。測序分析發(fā)現，ygl13突變體在OsSIG1（LO_OsOSg06630）編碼區(qū)發(fā)生突變導致蛋白翻譯提前終止。qRT-PCR結果表明，ygl13突變體中部分光合色素代謝途徑及光系統(tǒng)相關基因的表達發(fā)生紊亂［24］。

ygl63是以粳稻日本晴為背景的突變體，其整個生育期葉片均表現為黃綠色。ygl63突變體中葉綠素a、b和總葉綠素含量與野生型相比均下降，而葉綠素a/b值較野生型增加。結果表明葉綠素含量的降低是導致葉色變化的主要原因，并且葉綠素b比葉綠素a降低的幅度大。對農藝性狀調查發(fā)現，ygl63單株有效穗數和結實率較野生型均下降，而千粒重增加10.4%。株高，穗長和每穗著粒數與野生型無顯著差異。微量元素測定發(fā)現，ygl63種子中的鐵和鋅含量較野生型也降低。遺傳分析發(fā)現，ygl63突變性狀受1對隱性基因控制，YGL63基因定位到第11條染色體的長臂［25］。以上結果為后續(xù)研究YGL63基因的功能奠定基礎。

通過化學誘變水稻品系10079獲得ygl80突變體，其葉色為黃綠色，植株與野生型相比單株分孽減少，株高略微矮化。突變體從幼苗至抽穗結實收獲都呈現黃化表型。在苗期和孕穗期ygl80突變體中光合色素含量較野生型下降。遺傳分析結果表明該黃綠葉性狀由1對隱性核基因控制。定位分析結果表明該黃綠葉突變基因位于水稻第5染色體長臂上，為克隆該基因奠定了基礎［26］?；蚪M序列分析發(fā)現，ygl80突變體在編碼葉綠素合酶的YGL1（LOC_Os05g28200）基因編碼區(qū)發(fā)生突變，該基因是水稻ygl1黃綠葉突變基因的等位基因。但表型與ygl1有所區(qū)別，可能是突變位點不同造成的［27］。

ygl82突變體也是通過化學誘變水稻品系10079得到的，該突變體整個生長周期均表現為黃綠色，但能結實。ygl82突變體的生育期與野生型相比有所延遲，生長勢較弱，除劍葉寬增加外，株高、單株有效穗、穗長、每穗著粒數、劍葉長、結實率、千粒重均減少。突變體拔節(jié)期葉片中總葉綠素含量、葉綠素a、b及類胡蘿卜素的含量均低于野生型，而葉綠素a/葉綠素b比值增加。說明該突變體的光合色素的合成受到抑制。透射電鏡觀察分析表明，ygl82突變體的類囊體片層比野生型減少，線粒體結構異常，嵴變少甚至消失。說明該突變體的葉綠體和線粒體的發(fā)育均受到抑制。遺傳分析表明ygl82的突變性狀由1對隱性核基因控制。ygl82突變體的基因定位在第6染色體短臂上的InDel標記ST-1和ST-2之間116 kb的區(qū)域內，與兩標記的遺傳距離分別為0.44 cM和0.55 cM［28］。以上結果為克隆目的基因及探明該黃綠葉突變體的分子機制奠定了基礎。

ys83苗期表現出黃綠葉，至分蘗期表現出亮綠色。葉片中光和色素含量降低，并且葉綠體發(fā)育遲緩。突變表型受核隱性基因控制，定位至第2染色體短臂上。圖位克隆和測序分析發(fā)現YS83編碼的基因為含165個氨基酸的LOC_Os02g05890。YS83在各種組織中均有表達，其編碼蛋白存在于葉綠體中。突變體有效穗數、穗粒數稍有降低。結實率和千粒重沒有受到影響［29］，因此突變基因ys83可以作為標記性狀用于雜交水稻生產。

突變體ygl98也是來自10079品系，該突變體整個生育期葉片均表現為黃綠色。突變體中的葉綠素和類胡蘿卜素含量較野生型均下降，株高、有效穗數和結實率均降低。透射電鏡觀察顯示，ygl98突變體中葉綠體形狀不規(guī)則，且其中有許多空的囊泡狀結構，類囊體數目減少。遺傳分析表明，ygl98的突變性狀由1對隱性核基因控制。突變基因定位在第3染色體長臂上。序列分析發(fā)現，ygl98突變體中編碼鎂離子螯合酶ChlD亞基的OsChlD基因發(fā)生突變［30］。說明OsChlD為候選基因。

突變體yg1209是從國91與鎮(zhèn)稻88的BC4F3后代中分離得到的黃綠葉突變體，該突變體在苗期、分蘗期及抽穗期葉片中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量與野生型相比均降低，其中葉綠素b的含量降幅最大。株高、抽穗期、有效穗數、主莖穗總粒數、結實率和千粒重與野生型相比無顯著差異。遺傳分析表明，yg1209的黃綠葉性狀由1對隱性核基因控制。yg1209的葉色突變基因定位于第1染色體著絲粒附近。由測序結果推測LOC_Os0lg31110即為yg1209的候選基因［31］。

ygl4（t）是利用EMS誘變秈稻恢復系縉恢10號得到的突變體，該突變體全生育期表現為黃綠葉，植株的劍葉長、有效穗與每穗粒數與野生型相比無明顯差異，而株高、千粒質量、結實率等均顯著低于野生型。葉綠素a質量分數、凈光合速率、蒸騰速率與野生型無顯著差異，而葉綠素b與總葉綠素的質量分數、Chla/Chlb、氣孔導度與胞間CO2濃度均顯著低于野生型。此外，突變體的葉綠體基粒片層減少，排列不規(guī)則，導致葉綠體的發(fā)育受到抑制。遺傳分析表明，該性狀受1對隱性核基因控制，YGL4（t）定位于水稻第10染色體。序列分析表明，ygl98突變體中編碼葉綠素a氧化酶的OsCAO1基因發(fā)生了突變，推測OsCAO1即為YGL4（t）的候選基因［32］。以上結果為研究YGL4（t）基因的功能奠定了基礎。

ygl11（t）是一個黃綠葉自然突變體，其整個生育期葉片都表現為黃綠色。苗期、分蘗盛期、齊穗期突變體葉綠素a、b及類胡蘿卜素的含量均低于野生型。該突變體在分蘗盛期的凈光合速率顯著高

于野生型，而花后10 d，其凈光合速率與野生型相比稍微降低。葉綠體的超微結構觀察顯示，突變體葉綠體的類囊體基粒片層數目減少且不規(guī)則。遺傳分析表明，ygl11（t）葉色性狀受1對隱性核基因控制。分子標記將YGL11（t）定位于水稻第10染色體的長臂上。序列分析發(fā)現ygl11（t）突變體中編碼葉綠素a氧化酶的OsCAO1基因發(fā)生突變，初步分析OsCAO1可能為突變體中的候選基因［33］。以上結果對進一步研究該基因的功能有重要作用。

表1 水稻黃綠色突變體基因的定位及表型

ygl138（t）是以水稻日本晴為背景的突變體，其在整個生育期葉片均表現為黃綠色，葉綠素含量降低，葉綠體發(fā)育受阻。該突變表型受核基因控制。YGL138（t）定位于第11染色體上。突變體中Os11g05552基因發(fā)生突變，其編碼葉綠體信號識別顆粒cpSRP54參與葉綠體的發(fā)育，并且用轉基因互補實驗也驗證了該基因的功能，所以Os11g05552基因為候選基因［34］。以上結果對進一步研究YGL138（t）基因的功能以及SRP54蛋白參與葉綠體發(fā)育的機制具有重要作用。

2 水稻黃綠葉突變體基因的定位及突變表型總結

根據以上對水稻黃綠葉突變體的研究現狀，對19個突變體中基因的定位以及基因突變后對植株葉片光合色素含量、葉綠體發(fā)育以及對植株農藝性狀的影響進行了總結（表1）。其中從染色體分布上除4、7、9號染色體外，在其它染色體上均有YGL基因突變導致的葉色變化。在19個突變體材料中由于不同基因發(fā)生突變導致葉色的變化，其中有2個是由于葉綠素合成酶發(fā)生突變、3個由于鎂離子螯合酶的D亞基（OsChlD）發(fā)生突變、1個是由于RNA聚合酶的σ因子OsSIG的等位基因發(fā)生突變、1個是由于血紅素加氧酶（HO1）發(fā)生突變、1個是由于尿苷酸激酶發(fā)生突變、2個是由于葉綠體信號識別顆粒（cpSRP43和cpSRP45）發(fā)生突變、3個是由于葉綠素a氧化酶（OsCAO1）發(fā)生突變導致葉色的變化。并且這19個突變體材料可以分為3大類，Ⅰ 類 包 括YGL1、YGL7、YGL13、YGL83、YGL209這5個基因發(fā)生突變對水稻產量未造成影響；Ⅱ類包 括YGL2、YGL3、YGL6、YGL8、YGL9、YGL10、YGL82、YGL98、YGL4（t）、YGL11（t）、YGL138（t）這11個基因發(fā)生突變影響葉綠體的發(fā)育；Ⅲ類包括YGL4、YGL63、YGL80這3個基因發(fā)生突變影響葉綠素的含量。

3 結語

葉綠素生物合成基因的突變會影響葉綠素合成，從而影響植物體內光合色素的含量及比例產生葉色突變體。目前，葉色突變體已廣泛應用于基礎研究和生產實踐。通過以上對水稻黃綠葉突變體研究的總結可知，YGL1、YGL7、YGL13、YS83、YGL209基因突變導致水稻葉片呈現黃綠色，而對水稻的產量沒有影響。因此，上述5個基因的突變體可作為可視化葉色標記，應用于良種繁育和雜交育種，還可以作為優(yōu)良種質資源。YGL6、YGL138（t）等11個基因的突變影響水稻葉綠體的發(fā)育，對于理解葉綠體的發(fā)育機制有重要作用。YGL4、YGL63、YGL80基因突變影響葉綠素含量，為研究葉綠素合成過程中的基因功能奠定基礎。同時，上述黃綠葉突變材料對研究水稻葉綠素生物合成途徑和光合作用機制有重要作用。此外，通過對水稻黃綠葉突變體基因功能的研究，可篩選出高光合效率的基因提高作物產量?？傊?，隨著植物生理學以及生物信息學、分子生物學、功能基因組學研究的不斷深入，葉色突變體的分子機理研究將會取得更大的進展，各種葉色突變體將會進一步有效的應用到農業(yè)生產中。