丹參素對(duì)急性胰腺炎大鼠腎損傷的保護(hù)作用及對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響*

吳燕麗 張海燕

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030）

急性胰腺炎（AP）是由于多種原因?qū)е乱鹊鞍酌冈谝认賰?nèi)被激活，引起胰腺組織自體消化、壞死等的一種急性胰腺炎癥反應(yīng)。流行病學(xué)研究表明，約15%～20%AP 患者可進(jìn)展為重癥急性胰腺炎（SAP）［1］。 SAP具有疾病進(jìn)展速度快、并發(fā)感染率高、致死率高等特征，嚴(yán)重者發(fā)生全身性炎癥反應(yīng)，累及腎臟、肺等重要器官，其中SAP導(dǎo)致的急性腎功能衰竭是危害患者生命安全的重要并發(fā)癥之一［2］。因此，有效地預(yù)防腎功能損傷對(duì)改善SAP患者預(yù)后和生存率具有重要意義。研究顯示，炎癥因子如腫瘤壞死因子（TNF）、白介素（IL）等參與SAP疾病進(jìn)展，調(diào)控炎癥因子水平可能控制SAP 疾病進(jìn)展［3］。 核因子-κB（NF-κB）通路是機(jī)體重要的信號(hào)通路之一，在炎癥性疾病如膿毒血癥中發(fā)揮作用，抑制NF-κB通路可有效緩解炎癥反應(yīng)［4］。丹參素是從植物丹參中提取的芳香酸類復(fù)合物，具有抗血栓、抗炎、抗氧化等功效，已有研究證明丹參對(duì)急性腎損傷具有保護(hù)作用，但其主要成分丹參素在SAP所致腎損傷中的作用尚不清楚［5］。本研究通過建立急性壞死性胰腺炎（ANP）大鼠模型，觀察丹參素對(duì)ANP大鼠腎損傷的保護(hù)作用，并初步探究其作用機(jī)制，旨在探究丹參素治療ASP疾病的潛在作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠，SPF級(jí)，60只，體質(zhì)量170～190 g，購自上海邦耀公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）-2014-0002。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水/食，術(shù)前12 h進(jìn)行禁食處理、不禁水。本研究中所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 丹參素（純度≥98%，批號(hào)：67920-52-9），購自成都瑞芬思生物科技公司；醋酸奧曲肽注射液（規(guī)格：0.1 mg，以奧曲肽計(jì)，批號(hào)：H20090291），購自江蘇奧賽康藥業(yè)公司；4%多聚甲醛、HE染色試劑盒、蛋白提取試劑盒，購自上海生工生物技術(shù)公司；戊巴比妥鈉、BCA試劑盒、戊二醛，購自碧云天公司；大鼠TNF-α ELISA試劑盒、大鼠IL-6 ELISA試劑盒、大鼠IL-8 ELISA試劑盒，購自美國R&D Systems公司；兔源一抗 Anti-NF-κB、Anti-cleaved-caspase3、Anti-GAPDH、羊抗兔二抗，購自美國abcam公司；DAB顯色試劑盒，購自北京百奧萊生物公司；全自動(dòng)生化檢測儀（AU5800），購自美國 Beck C公司；光學(xué)顯微鏡（CX23），購自日本奧林巴斯公司；蛋白電泳儀、全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；石蠟切片機(jī)（SDSGA9000）等，購自上?？茀R生物公司等。

1.3 模型制備 參照文獻(xiàn)中方法制備ANP模型大鼠［6］。手術(shù)開始前，給予各大鼠麻醉處理，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉（40 mg/kg），切開大鼠腹部正中，暴露并分離出十二指腸，采用注射器刺開胰膽管與十二指腸膜乳頭開口下緣，于硬膜外置入5 cm導(dǎo)管，緩慢推進(jìn)后扎合切口；將輸液轉(zhuǎn)換器接于導(dǎo)管末端，以0.2 mL/min速度逆行泵入5%牛黃膽酸鈉（0.1 mL/kg），持續(xù)10 min，移除扎合線，退出導(dǎo)管，迅速縫合手術(shù)切口，歸位十二指腸，逐層縫合腹腔，消毒后送回動(dòng)物中心。假手術(shù)組，不穿刺泵藥，僅打開腹腔后縫合。本研究制備SNP模型過程中無大鼠死亡，共50只大鼠造模成功，術(shù)后進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 分組與給藥 按照隨機(jī)數(shù)表法將50只ANP大鼠隨機(jī)分為ANP組，奧曲肽組，丹參素低、中、高劑量組，每組10只，另設(shè)假手術(shù)組10只。丹參素低、中、高劑量組于術(shù)前 7 d， 定時(shí)給予丹參素 5、10、20 mg/（kg·d）灌胃治療；奧曲肽組于術(shù)前7 d，定時(shí)給予奧曲肽2.4 mg/（kg·d）灌胃治療；假手術(shù)組及 ANP 組于術(shù)前7 d，定時(shí)給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 造模24 h后，給予麻醉各組大鼠，腹主動(dòng)脈血采血5 mL，用于腎功能及炎癥因子檢測；立即取出大鼠胰臟、腎臟，洗凈后分別對(duì)稱切半，一半置于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；一半切碎后置于液氮中速凍，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。1）腎功能檢測。采用低溫離心機(jī)以3000 r/min轉(zhuǎn)速，將血液標(biāo)本離心10 min，取部分上清液，采用全自動(dòng)生化檢測儀測定各組大鼠血清中血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Scr）含量。 2）蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察胰腺組織及腎組織病變。對(duì)大鼠胰腺組織和腎組織石蠟切片脫蠟、水化后，采用HE染色試劑盒對(duì)各切片進(jìn)行染色，中性膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下，觀察大鼠胰腺組織、腎組織形態(tài)并采用半定量病理評(píng)估法對(duì)大鼠胰腺組織和腎小管損傷程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。3）血清TNF-α、IL-6、IL-8水平測定。采用大鼠TNF-α ELISA試劑盒、大鼠IL-6 ELISA試劑盒、大鼠IL-8 ELISA試劑盒檢測各大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平。4）蛋白印跡法檢測NF-κB蛋白表達(dá)水平。制備大鼠腎組織勻漿液，采用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒分別提取細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核總蛋白，采用BCA試劑盒分別測定細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核蛋白總量。SDS-凝膠電泳分離蛋白，采用全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜；加入5%脫脂奶粉，封閉1 h；PBS沖洗后分別加入兔源一 抗 Anti-NF-κB、Anti-cleaved-caspase3、Anti-GAPDH（1∶500）進(jìn)行孵育，4 ℃過夜；加入羊抗兔二抗（1∶4000）孵育，室溫 1 h。 經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑作用后，采用Tanon軟件檢測、分析并拍攝圖像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 丹參素對(duì)ANP大鼠胰腺、腎組織結(jié)構(gòu)的影響1）胰腺組織。假手術(shù)組大鼠胰腺細(xì)胞規(guī)則，排列緊密，呈現(xiàn)胰島；ANP組大鼠胰腺組織現(xiàn)空泡樣改變、炎性細(xì)胞浸潤、不規(guī)則間隙及壞死組織；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠胰腺組織損傷明顯改善，呈劑量依賴效應(yīng)。見圖1。2）腎臟組織。假手術(shù)組大鼠腎小管和腎小體結(jié)構(gòu)清晰、腎間質(zhì)無水腫、腎皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)完整；與假手術(shù)組比較，ANP組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)腫脹、腎小球萎縮、腎皮質(zhì)出現(xiàn)細(xì)胞水腫、壞死、有炎性細(xì)胞、小管腔凝固壞死等病變；丹參素低、中、高劑量組大鼠腎皮質(zhì)細(xì)胞損傷減輕，腎小球萎縮減輕等病理程度減輕。見圖2。病理評(píng)分結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，ANP組大鼠胰腺組織、腎組織的評(píng)分顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠胰腺組織、腎組織評(píng)分明顯下降（P＜0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。見表1。

圖1 各組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)（HE染色，400倍）

圖2 各組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)（HE染色，400倍）

2.2 丹參素對(duì)ANP大鼠腎功能的影響 見表2。與假手術(shù)組比較ANP組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯減少（P＜0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。

表1 各組ANP大鼠胰腺組織、腎組織病理評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組ANP大鼠胰腺組織、腎組織病理評(píng)分比較（分，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與丹參素低劑量組比較，※P＜0.05；與丹參素中劑量組比較，◇P＜0.05。 下同

組 別 n 胰腺組織 腎組織假手術(shù)組 1 0 0.3 9±0.0 6 0.4 5±0.0 8 A N P 組 1 0 8.1 3±1.6 3* 4.9 9±0.9 8*奧曲肽組 1 0 3.2 4±0.6 4*# 2.8 9±0.5 6*#丹參素低劑量組 1 0 6.5 0±1.2 7*# 4.4 2±0.8 7*#丹參素中劑量組 1 0 4.1 7±0.8 4*#※ 3.6 8±0.7 4*#※丹參素高劑量組 1 0 2.6 8±0.5 2*#※◇ 2.7 5±0.5 5*#※◇

表2 各組ANP大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）

表2 各組ANP大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）

組 別 n B U N（m m o l/L） S c r（μ m o l/L）假手術(shù)組 1 0 8.1 4±1.6 1 2 7.3 7±5.4 6 A N P 組 1 0 3 7.5 4±7.4 9* 2 0 3.5 4±3 9.4 6*奧曲肽組 1 0 1 4.1 9±2.8 2*# 1 0 3.2 8±1 9.9 7*#丹參素低劑量組 1 0 3 1.0 5±6.1 9*# 1 8 6.5 3±3 5.3 6*#丹參素中劑量組 1 0 2 0.3 7±4.0 6*#※ 1 3 5.4 9±2 6.9 8*#※丹參素高劑量組 1 0 1 2.9 3±2.5 7*#※◇ 9 8.3 6±1 9.6 5*#※◇

2.3 丹參素對(duì)ANP大鼠炎癥反應(yīng)的影響 見表3。與假手術(shù)組比較，ANP組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠血清組織中TNF-α、IL-6、IL-8 水平顯著降低（P＜ 0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。

表3 各組大鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-8 水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-8 水平比較（pg/mL，±s）

組別 n T N F-α假手術(shù)組 1 0 1 5 3.1 7±2 6.7 8 A N P 組 1 0 3 0 2.9 3±5 9.7 2*奧曲肽組 1 0 1 8 4.9 6±3 1.0 5*#丹參素低劑量組 1 0 2 6 7.4 1±5 0.6 7*#丹參素中劑量組 1 0 2 0 1.6 7±3 8.5 4*#※丹參素高劑量組 1 0 1 7 6.7 1±3 4.4 3*#※◇I L-6 I L-8 1 1 1.3 2±2 1.9 7 1 0 3.7 6±2 0.4 5 3 2 1.6 3±6 2.3 1* 2 8 6.8 1±5 1.2 3*1 4 9.2 7±2 9.4 9*# 2 5 1.4 2±4 8.9 7*#2 7 3.9 8±5 3.2 5*# 1 6 7.6 5±3 1.2 8*#2 3 2.6 1±4 3.6 7*#※ 1 1 9.2 4±2 1.7 6*#※1 3 7.5 4±2 5.7 6*#※◇ 1 1 1.3 9±2.1 4*#※◇

2.4 丹參素對(duì)ANP大鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響 見圖3、表4。與假手術(shù)組比較，ANP組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。

2.5 丹參素對(duì) ANP大鼠腎組織中 NF-κB、cleavedcaspase3蛋白表達(dá)的影響 見圖4、表5。與假手術(shù)組比較，ANP組大鼠細(xì)胞質(zhì)中cleaved-caspase3蛋白顯著增多、NF-κB蛋白顯著減少，細(xì)胞核中NF-κB蛋白明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠細(xì)胞質(zhì)中cleaved-caspase3蛋白顯著減少、NF-κB蛋白顯著增多 （P＜0.05），細(xì)胞核 NF-κB 蛋白顯著減少（P＜0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。

圖3 各組ANP大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色，200倍）

表4 各組ANP大鼠腎組織凋亡細(xì)胞比例的比較（±s）

表4 各組ANP大鼠腎組織凋亡細(xì)胞比例的比較（±s）

組 別 n 凋亡細(xì)胞比例（%）假手術(shù)組 1 0 4.7 3±0.9 1 A N P 組 1 0 4 9.4 6±8.6 3*奧曲肽組 1 0 1 2.3 5±2.6 1*#丹參素低劑量組 1 0 3 8.0 8±6.5 7*#丹參素中劑量組 1 0 2 1.6 7±4.1 3*#※丹參素高劑量組 1 0 8.2 9±1.5 1*#※◇

圖4 各組ANP大鼠腎組織NF-κB、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)

表5 各組ANP大鼠腎組織NF-κB、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的比較（±s）

表5 各組ANP大鼠腎組織NF-κB、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的比較（±s）

組別 n c l e a v e d-c a s p a s e 3/G A P D H假手術(shù)組 1 0 0.9 1±0.1 7 A N P 組 1 0 2.1 9±0.3 9*奧曲肽組 1 0 0.9 4±0.1 5#丹參素低劑量組 1 0 2.1 5±0.4 1*丹參素中劑量組 1 0 1.9 5±0.3 7*#※丹參素高劑量組 1 0 1.2 1±0.2 3*#※◇質(zhì) N F-κ B/H i s t o n e H 2 A 核 N F-κ B/G A P D H 1.1 2±0.2 1 0.2 1±0.0 4 0.4 9±0.0 8* 0.8 3±0.1 2*0.6 7±0.1 3*# 0.4 6±0.0 9*#0.5 3±0.1 1*# 0.7 2±0.1 3*#0.7 8±0.1 4*#※ 0.4 9±0.0 9*#※1.0 9±0.1 9*#※◇ 0.1 8±0.0 4*#※◇

3 討 論

AP是一種較為常見的消化系統(tǒng)疾病，其中多數(shù)AP患者具有自限性，一般在3～5 d內(nèi)恢復(fù)，預(yù)后效果好，但某些AP患者可能繼發(fā)腹膜炎、全身性炎癥反應(yīng)、多臟器功能衰竭等并發(fā)癥，腎臟是最易累及的器官之一［7］。本研究采用胰膽管逆行穿刺結(jié)合牛黃膽酸鈉法復(fù)制ANP大鼠模型，HE染色結(jié)果顯示，ANP組大鼠胰腺組織現(xiàn)空泡樣改變、炎性細(xì)胞浸潤及細(xì)胞等病變；腎皮質(zhì)出現(xiàn)細(xì)胞壞死、產(chǎn)生炎性細(xì)胞、腎小管結(jié)構(gòu)腫脹、小管腔凝固等病變，且ANP組大鼠血清中BUN和Scr含量明顯增高，表明ANP可導(dǎo)致大鼠腎損傷，模型制備成功。

丹參素是來自藥用植物丹參的主要水提取物之一，是復(fù)方丹參注射液等多種藥物的主要功效成分［8］。研究表明，丹參川芎嗪注射液可通過降低血清TNF-α等炎癥因子含量，改善急性顱腦損傷患者臨床癥狀，緩解神經(jīng)功能障礙［9］。陳芳等曾報(bào)道，丹參通脈方可通過降低IL-6等炎性因子的表達(dá)，抑制凋亡通路激活，從而減輕人血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷［10］。以上研究提示，丹參類藥物具有一定炎癥抑制功效，可改善炎癥反應(yīng)異常所致疾病。但丹參素在ANP所致腎損傷的作用機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參素可明顯減輕ANP所致大鼠腎功能障礙，減輕胰腺和腎臟組織病理損傷程度，降低血清中BUN和Scr水平，提示丹參素對(duì)ANP大鼠腎損傷具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制并不清楚。

ASP患者血清炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，嚴(yán)重者可引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)，威脅肺臟、腎臟等組織器官正常功能，是ASP造成多器官組織損傷的主要原因之一［11］。白細(xì)胞介素是一種細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等生理過程［12］。腫瘤壞死因子是一種具有較強(qiáng)免疫活性的細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生，參與炎癥反應(yīng)等多種生理過程［12-13］。Chen等發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過降低血清和腎組織中炎癥因子水平抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性腎損傷所致細(xì)胞凋亡，改善腎功能［14］。 Latchoumycandane 等研究顯示，抗炎藥物?；撬崽幚砜赏ㄟ^抑制大鼠腎脂質(zhì)氧化、減輕炎性細(xì)胞浸潤，改善酒精誘導(dǎo)的腎炎性損傷［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，ANP組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著升高；與ANP組比較，丹參素低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著降低，表明丹參素預(yù)處理可降低ANP大鼠血清炎癥因子水平，提示丹參素可能通過抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)保護(hù)ANP所致大鼠腎損傷。

研究表明，炎癥因子的大量產(chǎn)生不僅可以對(duì)組織細(xì)胞造成損傷，還能激活凋亡相關(guān)基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄［16］。另外，TNF-α等炎癥因子可通過一系列信號(hào)傳導(dǎo)，促使NF-κB從其抑制蛋白中分離、釋放，移位進(jìn)入細(xì)胞核而激活，誘導(dǎo)caspase等凋亡蛋白發(fā)生水解活化，激活細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡的異常也是造成腎組織損傷的原因之一［17］。董永喜等發(fā)現(xiàn)，辛芍組方可抑制NF-κB通路的活化，抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，ANP大鼠腎組織凋亡細(xì)胞比例明顯升高，丹參素低、中、高劑量組可顯著降低ANP大鼠腎組織凋亡細(xì)胞比例，提示丹參素可減輕ANP所致大鼠腎細(xì)胞凋亡。另有研究顯示，TNF-α誘導(dǎo)NF-κB通路的激活，在順鉑所致腎小管上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［19］。Ozkok等研究表明，抑制NF-κB通路的激活可顯著抑制腎小管細(xì)胞凋亡和壞死，改善順鉑所致腎功能損傷［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，ANP大鼠腎組織細(xì)胞中NF-κB蛋白核移位程度明顯增高、cleaved-caspase3蛋白顯著增多；低、中、高劑量丹參素干預(yù)后，ANP大鼠腎組織細(xì)胞中NF-κB蛋白核移位程度顯著降低、cleaved-caspase3蛋白顯著減少，表明丹參素具有抑制NF-κB通路和caspase3蛋白激活的功效，提示丹參素可能通過抑制NF-κB通路的激活來保護(hù)ANP所致腎損傷。