益氣活血化瘀湯對膜性腎病大鼠腎臟組織Podocin表達(dá)的影響*

陳玲玲 左 揚(yáng) 馮 源 程錦國△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州市中醫(yī)院，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州325000）

膜性腎?。∕N）是成人腎病綜合征的主要病因［1］，臨床上主要表現(xiàn)為蛋白尿或者腎病綜合征。近年來其發(fā)病率逐漸上升，成為繼IgA腎病后我國慢性腎臟病病理類型的又一大構(gòu)成，并且年輕人的發(fā)病率在不斷增高［2-3］。膜性腎病的病理表現(xiàn)多為腎小球基底膜（GBM）增厚以及上皮下免疫復(fù)合物的沉積［4-5］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療膜性腎病采用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素聯(lián)合細(xì)胞毒類藥物以及利妥昔單抗［6-7］等治療，存在治療費(fèi)用昂貴，副作用大，療效欠佳等問題。近年來中醫(yī)學(xué)在膜性腎病的治療及延緩其進(jìn)展方面的研究也取得了較多的成果。益氣活血化瘀湯是程錦國教授在中醫(yī)理論指導(dǎo)下制定的自擬方，具有益氣升陽、活血化瘀、清熱燥濕的功效，在臨床上治療膜性腎病有較好的療效。本研究旨通過被動性Heymann腎炎大鼠模型［8］，觀察益氣活血化瘀湯對膜性腎病的影響及可能機(jī)制，為臨床防治膜性腎病尋找新的途徑和干預(yù)靶點(diǎn)以及提供實(shí)驗(yàn)材料支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性健康SD成年大鼠36只，體質(zhì)量（150±20）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2015-0009，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)SPF級動物房。飼養(yǎng)溫度維持在20℃，分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)動物干飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水。

1.2 試藥與儀器 益氣活血化瘀湯（組成：黃芪30 g，炒白術(shù) 20 g，黨參 20 g，茯苓 30 g，當(dāng)歸 12 g，陳皮12 g，忍冬藤 30 g，澤瀉 30 g，漏蘆 30 g，菝葜 20 g，黃柏10 g，天龍1 g）經(jīng)常規(guī)煎煮、過濾、水浴蒸發(fā)等步驟，濃縮至生藥含量分別為 2.083、4.166、8.332 g/mL規(guī)格，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠炮制中心提供；洛丁新片（鹽酸貝那普利片，北京諾華制藥有限公司，批號：X2342）。 抗 Fx1A 抗血清 （25 mL，PTX-002S，Probetex）、抗 Podocin 抗體（100μL，ab181143，abcam）、FITC標(biāo)記抗大鼠 IgG（100 μL，WD-0294R，達(dá)文生物）、C3抗體 （200 μg，sc-28294，Santa Cuz）、AF488 標(biāo)記抗鼠二抗（100 μL，DW-GAM4881，達(dá)文生物）、DAB 顯色試劑盒、超敏二步法免疫組化檢測試劑盒 （ZLI-9018，PV-6001，北京中杉金橋公司）。光學(xué)顯微鏡、病理切片機(jī)（德國Leica公司）；微量加樣槍（德國Eppendorf公司）；全自動生化分析儀 （美國Beckman公司Coulter AU5800）。

1.3 造模與分組 雄性SPF級SD大鼠36只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周并檢測24 h尿蛋白定量均小于10 mg后開始造模。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白對照組6只及造模組30只。造模組大鼠給予一次性尾靜脈注射抗Fx1A血清0.6 mL/100 g體質(zhì)量，空白對照組大鼠給予一次性尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液0.6 mL/100 g體質(zhì)量，7 d后檢測24 h尿蛋白定量＞10 mg則為模型建立成功。造模成功的大鼠隨機(jī)均分為5組，即模型組、洛丁新組、益氣活血化瘀湯低、中、高劑量組，每組6只。造模過程中死亡的大鼠給予隨機(jī)補(bǔ)充，使每組均保持在6只。

1.4 干預(yù)方法 造模成功后即造模后第7天開始灌胃。正常對照組、模型組給予0.9%氯化鈉注射液10 mL/kg體質(zhì)量；洛丁新組給予洛丁新片0.8 mg/kg（0.8 mg/mL）體質(zhì)量；益氣活血化瘀湯的給藥劑量為10 mL/kg體質(zhì)量，其高、中、低劑量分別按照體質(zhì)量為60 kg的成人每日生藥量的20、10、5倍（灌胃生藥含量分別為8.332、4.166、2.083 g/mL的濃縮液）計(jì)算。各組均給藥4周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 分別用代謝籠收集造模后第7、14、21、28、35 天的 24 h 尿液，記錄尿量，離心沉淀后去上層清液檢測24 h尿蛋白定量。在造模第35天處死大鼠，采用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，用采血針心臟取血，3500 r/min、5 min離心后取上層血清用于檢測生化指標(biāo)。摘取大鼠兩邊腎臟，去掉包膜，分切腎組織，分別置于4%多聚甲醛溶液中室溫固定，用0.9%氯化鈉注射液浸濕的紗布包裹，-20℃凍存，剩余腎臟組織置于液氮中速凍保存。1）血尿生化檢測：將收集的24 h尿液采用免疫比濁法測24 h尿蛋白定量；心臟取血收集的血液送檢至溫州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，檢測血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、血清總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、三酰甘油（TAG）。2）腎臟組織病理學(xué)檢測：腎臟組織用4%多聚甲醛溶液室溫固定24 h，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊后切片成3 μm石蠟切片，按常規(guī)方法進(jìn)行HE、Masson、PASM染色，光鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)改變。3）免疫組化檢測：石蠟切片后常規(guī)脫蠟至水，過氧化氫室溫浸泡10 min后蒸餾水洗，高溫高壓抗原修復(fù)，冷卻至室溫后PBS洗3次，每次 5 min，滴加一抗，抗 Podocin 抗體（1∶500）4 ℃過夜。超敏二步法免疫組化檢測法，滴加二抗，室溫孵育 20 min，PBS洗 3次，每次 5 min，DAB 顯色 3.5 min，自來水沖洗、蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、水洗返藍(lán)、脫水、透明、封片。400倍光鏡下觀察，每張切片隨機(jī)取上、下、左、右、中5個不重疊視野，拍照；采用Image Pro Plus 6.0軟件對采集的圖像進(jìn)行累積光密度值（IOD值）進(jìn)行分析，用以檢測Podocin抗體的表達(dá)量。4）免疫熒光檢測：大鼠腎臟組織切片至4 μm冰凍切片，PBS浸洗 20 min，滴加一抗，37℃孵育 2 h，PBS洗3次，各5 min，其中IgG為直接免疫熒光抗體，直接滴加甘油封片；滴加二抗，37℃孵育2 h，PBS洗3次，各5 min，封片。熒光顯微鏡下觀察IgG和C3的沉積情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法（LSD），方差不齊時采用Dunnett T3檢驗(yàn)。P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物一般情況 正常對照組大鼠狀態(tài)良好，活潑好動，毛發(fā)光滑，進(jìn)食正常。造模組大鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，毛發(fā)光澤度減弱，毛發(fā)脫落，進(jìn)食減少。

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白定量和血生化指標(biāo)改變見表1～表2。造模7 d后，模型組、洛丁新組及益氣活血化瘀湯各劑量組的24 h蛋白尿定量明顯高于正常對照組（P＜0.05）。造模21 d后，洛丁新組及益氣活血化瘀湯各劑量組的24 h蛋白尿定量開始減少。造模35 d后洛丁新組及益氣活血化瘀湯各劑量組的24 h蛋白尿定量明顯低于模型組（P＜0.05），益氣活血化瘀湯各劑量組24 h蛋白尿低于洛丁新組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。益氣活血化瘀湯低、中、高劑量組之間比較，24 h尿蛋白定量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。各組大鼠的生化水平比較，造模后，大鼠TP、ALB較正常組降低，洛丁新組及益氣活血化瘀湯各劑量組較模型組升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；其余生化指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠24 h蛋白尿定量比較（mg，±s）

表1 各組大鼠24 h蛋白尿定量比較（mg，±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組 別 n正常對照組 6模型組 6洛丁新組 6 2 8 d 3 5 d 1 2.1 3±2.1 8 1 1.5 7±1.6 8 5 2.8 4±1 1.7 0* 5 4.0 5±8.5 7*4 3.0 9±8.7 0* 3 6.9 7±6.5 4*△益氣活血化瘀湯低劑量組 6 2.7 5±1.3 7 5 3.0 4±2 2.2 2* 5 1.0 1±1 5.5 1* 4 0.5 7±1 0.6 3* 3 5.0 1±8.8 3* 3 0.0 3±5.5 4*△益氣活血化瘀湯中劑量組 6 2.4 8±1.3 7 5 5.9 5±1 6.6 1* 5 6.0 9±1 4.0 1* 3 8.8 3±9.3 7* 3 2.1 8±9.0 3* 2 8.0 6±9.2 4△益氣活血化瘀湯高劑量組 6 2.8 8±1.0 4 5 3.8 6±1 6.5 5* 5 3.8 7±1 7.9 0* 3 8.7 3±6.9 6* 3 1.6 0±3.8 1* 2 9.8 2±2.9 7*△0 d 7 d 1 4 d 3.6 2±1.5 2 4.6 9±2.1 1 9.4 9±4.4 5 2.5 4±1.1 4 6 5.7 3±2 9.9 6* 7 3.9 1±3 3.7 8*2.3 6±0.5 6 6 4.2 4±2 7.5 6* 6 7.4 2±2 6.4 8*2 1 d 1 4.5 2±3.3 7 6 4.9 8±2 3.9 1*6 0.2 9±1 9.1 0*

表2 各組大鼠生化水平比較（±s）

表2 各組大鼠生化水平比較（±s）

?組 別 n正常對照組 6模型組 6洛丁新組 6 T C（m m o l/L）1.6 1±0.2 0 1.8 1±0.4 6 2.1 2±0.3 9益氣活血化瘀湯低劑量組 6 5 5.6 5±2.1 2 3 6.5 0±1.7 0 3 0.1 7±5.5 3 5.9 0±0.9 0 1.8 7±0.3 0益氣活血化瘀湯中劑量組 6 5 4.4 0±2.2 0 3 6.2 8±1.1 2 3 0.5 0±6.1 9 6.2 1±0.9 7 1.8 6±0.7 3益氣活血化瘀湯高劑量組 6 5 5.4 2±2.3 0 3 6.8 3±2.0 7 2 8.0 0±6.3 2 5.6 7±1.2 6 1.8 7±0.5 6 T P（g/L） A L B（g/L） S c r（μ m o l/L）5 5.5 0±1.2 2 3 7.9 5±2.6 2 3 0.3 3±1 1.1 3 5 3.5 3±3.1 0 3 5.5 3±2.5 2 2 8.8 3±5.9 8 5 3.8 3±1.7 8 3 6.7 3±2.7 7 3 0.3 3±9.1 4 B u n（m m o l/L）5.7 2±1.6 3 5.7 5±1.1 1 6.1 1±1.1 2 H D L-C（m m o l/L） T A G（m m o l/L）0.5 6±0.0 5 0.3 5±0.1 5 0.5 8±0.0 8 0.3 5±0.0 8 0.6 8±0.0 3 0.3 9±0.1 6 0.6 4±0.1 3 0.3 3±0.1 3 0.6 4±0.1 5 0.3 4±0.1 6 0.6 1±0.1 2 0.2 8±0.0 7

2.3 各組大鼠腎臟組織病理改變 見圖1～圖3。HE染色結(jié)果顯示，正常對照組腎組織未見明顯的病理學(xué)改變；造模組腎小球體積增大，腎小球毛細(xì)血管壁有不同程度的增厚，血管腔開放良好，系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生。Masson染色結(jié)果顯示，造模組腎小球上皮下有大量嗜復(fù)紅蛋白沉積；PASM染色結(jié)果顯示，造模組腎小球毛細(xì)血管壁增厚，部分腎小球基底膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞增生，上皮下有“釘突”形成，部分小管內(nèi)皮細(xì)胞脫落，刷狀緣消失。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)改變（HE染色，400倍）

2.4 各組大鼠腎臟組織免疫熒光IgG和C3沉積情況見圖4～圖5。正常對照組顯示IgG和C3均為陰性；模型組及洛丁新組、益氣活血化瘀湯各劑量組顯示IgG和C3均沿腎小球毛細(xì)血管壁呈細(xì)顆粒狀沉積；IgG免疫熒光結(jié)果顯示，模型組及洛丁新組的熒光強(qiáng)度為（+++～++++），益氣活血化瘀湯各劑量組的熒光強(qiáng)度為（+～++），其中低劑量組及中劑量組的熒光強(qiáng)度較高劑量組弱。C3免疫熒光結(jié)果顯示，模型組及益氣活血化瘀湯各劑量組的熒光強(qiáng)度為（++～+++），較模型組弱，益氣活血化瘀湯各劑量組之間無明顯差異，洛丁新組熒光強(qiáng)度為（+）。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)改變（Masson染色，400倍）

圖3 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)改變（PASM染色，400倍）

圖4 各組大鼠腎組織免疫熒光C3沉積情況（400倍）

2.5 各組大鼠腎臟組織Podocin陽性表達(dá)情況比較見圖6，表3。與正常對照組比較，模型組Podocin表達(dá)明顯減少（P＜0.01）。與模型組比較，洛丁新組及益氣活血化瘀湯各劑量組Podocin表達(dá)都較模型組升高，其中益氣活血化瘀湯各劑量組較洛丁新組升高明顯（P＜0.01），益氣活血化瘀湯各劑量組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組大鼠腎臟組織Podocin表達(dá)情況比較（±s）

表3 各組大鼠腎臟組織Podocin表達(dá)情況比較（±s）

與洛丁新組比較，＃P＜0.01

?組 別正常對照組模型組洛丁新組P o d o c i n I O D 1 2 7 0 4.1 8±4 1 1 0.3 6△3 9 6 2.8 9±2 4 4 8.3 0*6 3 6 2.6 7±6 0 0 1.4 8*益氣活血化瘀湯低劑量組 1 2 4 2 6.0 0±3 4 5 2.8 4△＃益氣活血化瘀湯中劑量組 1 2 2 9 2.6 7±3 7 7 4.4 5△＃益氣活血化瘀湯高劑量組 1 6 0 5 2.6 2±7 5 9 4.2 9△＃

圖6 各組大鼠腎臟組織免疫組化Podocin表達(dá)情況（400倍）

3 討 論

膜性腎病臨床多表現(xiàn)為蛋白尿，而蛋白尿持續(xù)性增加作為腎損傷標(biāo)志，對腎臟疾病的治療和預(yù)后判斷有具有指導(dǎo)意義［9］。近年來，許多研究表明蛋白尿的產(chǎn)生與腎小球?yàn)V過屏障有著密切的關(guān)系，而足細(xì)胞裂孔膜（SD）作為腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分［10-11］，與蛋白尿的產(chǎn)生息息相關(guān)［12］，是近年來的一大研究熱點(diǎn)。Podocin是足細(xì)胞裂孔膜的重要組成部分之一，它以發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)插入足突膜，與Nephrin及CD2AP等其他蛋白配合作用，共同維持裂孔膜構(gòu)造和功能的完整性［13-14］。有研究表明［15］，在 Heymann 早期免疫熒光染色顯示Podocin已經(jīng)從現(xiàn)狀變成粒狀，Podocin的表達(dá)減少以及它與Nephrin的分離可能促進(jìn)了蛋白尿在膜性腎病中的發(fā)展；Podocin在特發(fā)性膜性腎病和繼發(fā)性膜性腎病中均表達(dá)減少，其表達(dá)改變可能是導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障受損，產(chǎn)生大量蛋白尿的直接原因［16］。以上都說明了膜性腎病蛋白尿的產(chǎn)生可能與腎臟組織Podocin蛋白的表達(dá)減少有關(guān)。

中醫(yī)學(xué)古籍中并無膜性腎病的記載，根據(jù)其臨床特征可大致歸屬于中醫(yī)學(xué)的“水腫”“尿濁”“腰痛”等病證范疇。許多醫(yī)家認(rèn)為，膜性腎病的病機(jī)特點(diǎn)是本虛標(biāo)實(shí)，本虛主要是脾腎兩虛，標(biāo)實(shí)是濕熱、水濕、瘀血等［17-18］。益氣活血化瘀湯為本文通信作者程錦國教授的自擬方，程錦國教授認(rèn)為膜性腎病多系肺、脾、腎虛損，水液及氣血運(yùn)行失常，引起水濕、濕熱、濁毒等壅結(jié)于內(nèi)，進(jìn)一步導(dǎo)致瘀血內(nèi)停，精微外泄［19］。方中黃芪、黨參補(bǔ)氣升陽、健脾益肺為君，白術(shù)、茯苓健脾滲濕，當(dāng)歸養(yǎng)血補(bǔ)血活血，使活血而血不妄行，散瘀而正氣不損，陳皮理氣燥痰化濕為臣藥，忍冬藤、澤瀉、漏蘆、黃柏清熱解毒燥濕，天龍活絡(luò)散結(jié)，使氣行則血行。諸藥合用共奏益氣升陽、活血化瘀、清熱燥濕之功。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，益氣活血化瘀湯可以上調(diào)膜性腎病大鼠Podocin蛋白的表達(dá)，減少膜性腎病大鼠蛋白尿的產(chǎn)生，在一定程度上維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的正常以及腎小球?yàn)V過屏障功能的完整性，從而達(dá)到保護(hù)腎臟功能，延緩腎臟病理改變。這可能是益氣活血化瘀湯對膜性腎病的作用機(jī)制之一，其對足細(xì)胞以及腎小球?yàn)V過屏障功能的其他作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。