參芎化瘀膠囊通過MAPK/ERK對腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)保護作用研究*

楊徐一 許仁軍 楊黎萍 戴 杰

［1.浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）路橋醫(yī)院，浙江 臺州 318050；2.浙江省臺州市路橋廣興大藥房，浙江 臺州 318050］

腦卒中是嚴重威脅中國居民身體健康和生命安全的重大疾病之一，其中約70%腦卒中患者為腦缺血/再灌注（I/R）損傷，死亡率約為10%，致殘率高達50%以上［1］。參芎化瘀膠囊是由石菖蒲、川芎、人參、地鱉蟲、乳香、五味子、郁金等組成的中藥復合方劑，具有化瘀通絡等功效，可有效保護缺血/再灌注大鼠神經(jīng)元，改善大鼠認知功能［2］，但其具體作用機制尚不十分清楚。研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡是腦I/R損傷引起神經(jīng)細胞死亡的重要原因［3］。 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）通路通過調(diào)節(jié)轉錄因子的活性，參與調(diào)控細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡等多種生物學過程，MAPK/ERK信號通路異常激活可誘導細胞凋亡［4］。因此，本文通過研究參芎化瘀膠囊對腦I/R模型大鼠腦組織MAPK/ERK通路的調(diào)節(jié)作用，旨在探究其保護腦I/R損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠160只，SPF級，體質量（200±10）g，購自上海市醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK-（滬）20116-0001，批號：1140070009179。本研究涉及所有實驗均通過本院動物實驗倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器 參芎化瘀膠囊 （由河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院藥劑科提供，冀藥制Z20051586）；尼莫地平片（批號：Z15027），購自拜耳醫(yī)藥公司；ERK/MAPK激活劑 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate（TPA，貨號：N2060），購自美國APExBIO公司；4%多聚甲醛、DMSO、戊巴比妥鈉、TTC染料、HE染色試劑盒，購自上海生工生物技術公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，購自碧云天公司；兔抗MEK1/2多克隆抗體（貨號：ab131517）、兔抗 p-MEK1/2多克隆抗體（貨號：ab194754）、兔抗ERK1/2多克隆抗體（貨號：ab196883）、兔抗 p-ERK1/2多克隆抗體（貨號：ab201015）；兔抗 Bcl-2 單克隆抗體（貨號：ab32124）、兔抗Bax單克隆抗體（貨號：ab32503）、兔抗Caspase3單克隆抗體（貨號：ab13847），兔抗GAPDH單克隆抗體（貨號：ab181602），羊抗兔 IgG 抗體（貨號：ab205718），均購自美國Abcam公司。大鼠電動立體定向注射儀（型號：ALC-H），購自上海奧爾科特生物科技有限公司；熒光顯微鏡（型號：BX43），購自美國Olympus公司；石蠟烤片機 （型號：HI1220）、切片機 （型號：RM2235），購自德國Leica公司；蛋白電泳儀（型號：PowerPac 基礎）、半干轉膜儀（型號：1703940），購自美國Bio-Rad公司；Tanon發(fā)光成像系統(tǒng) （型號：5500），購自上海天能公司。

1.3 模型制備 術前給予大鼠2.5%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉。按照改進大腦中動脈線栓法（MACO）構建腦缺血/再灌注（I/R）模型大鼠［5］：將大鼠仰臥固定于手術臺，常規(guī)消毒。沿大鼠頸部正中偏左處切開皮膚，暴露出頸三角位置，采用鈍性分離法迅速分離出左側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA）。利用血管夾在遠心端結扎ECA及其分支，在近心端夾閉CCA和ICA。利用眼科剪在ECA距CCA分叉處約3～5 mm處作一斜向切口，輕輕推入特定腦栓尼龍線（直徑0.26 mm），至距CCA分叉處約19 mm處感覺有阻力時停止，將栓線在頸外動脈處扎緊?？p合手術切口并消毒。維持大腦缺血狀態(tài)2 h后，拉出栓線實現(xiàn)血液再灌注。術中、術后維持大鼠體溫均在（37±0.5）℃。假手術組，不植入腦栓尼龍線，其余步驟同模型組。造模成功標準：大鼠清醒后2 h，按照Longa EZ評分標準進行評分［6］。0分：神經(jīng)功能無任何損傷癥狀；1分：右前爪不能完全伸直；2分：行走時向右側不自主傾斜或向右側轉圈；3分：行走時向右側跌倒或向右側癱瘓；4分：出現(xiàn)昏迷，不能自主行走；5分，大鼠死亡。將1～3分大鼠納入本次研究，0、4、5分大鼠排除。另于手術造模后第5日，再次進行神經(jīng)功能評分。若實驗組大鼠數(shù)量不足預定數(shù)量，則通過隨機原則取備用大鼠補足。

1.4 分組與給藥 建模成功后，隨機分為模型組（含0.05%DMSO的0.9%氯化鈉注射液）、SHC組（參芎化瘀膠囊）、尼莫地平組（尼莫地平）和TPA組（參芎化瘀膠囊+TPA），每組30只，另設假手術組（含0.05%DMSO的0.9%氯化鈉注射液）30只。參芎化瘀膠囊、尼莫地平片溶于0.9%氯化鈉注射液中使用，給藥劑量參考動物體表面積劑量換算法［7］，按成人70 kg給藥劑量換算：參芎化瘀膠囊48 mg/kg，尼莫地平片15 mg/kg。造模成功后2 h，給予各組大鼠灌胃給藥1次，隨后每天同一時間按大鼠體質量灌胃相應藥物1次，連續(xù)5 d。模型組及假手術組同一時間給予等體積含0.05%DMSO的0.9%氯化鈉注射液灌胃處理。TPA溶于DMSO，0.9% 氯 化 鈉 溶 液 稀 釋 至 50 μmol/L（0.05%DMSO）使用，造模成功后2 h，采用立體定向注射儀于大鼠中線外側1.5 mm、前囟前0.8 mm處進行穿刺，深度3.5 mm，將10 μL TPA輕輕注入腦室內(nèi)，每天1次，連續(xù)5 d。

1.5 標本采集與檢測 1）TTC染色法檢測大鼠腦組織梗死體積：最后1次給藥24 h后，頸部脫臼處死，取缺血腦組織，-20℃，25 min；切為6片，置于 1%TTC溶液中，37℃孵育15 min；移至10%甲醛溶液（pH7.4）中固定。紅色部分為無梗死組織，白色部分為發(fā)生梗死組織。ImageProPlus軟件測量各切片梗死面積，計算腦梗死體積。每組隨機取10只大鼠檢測。2）HE染色法觀察腦組織形態(tài)：最后1次給藥24 h后，給予各組大鼠2.5%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，經(jīng)CCA灌注4%多聚甲醛初步固定后，取缺血側海馬組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（4 μm/片），進行脫蠟、水化處理。嚴格按照 HE 法染色流程對腦組織切片進行染色，中性膠封片，置于光學顯微鏡下，觀察大鼠腦組織形態(tài)并拍照。每組隨機取10只大鼠制備石蠟切片。3）AnnexinV-FITC/PI法檢測神經(jīng)細胞凋亡情況：最后1次給藥24 h后，頸部脫臼處死各組大鼠，取缺血側海馬組織，剪為1 mm3小塊，加入胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液，計數(shù)，取6～10萬個細胞，嚴格按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒說明書逐步進行染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率并分析。每組隨機取10只大鼠進行檢測。4)Western blotting 法檢測 Bcl-2、Bax、Caspase3、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達：研磨粉碎各組大鼠海馬組織樣品，加入蛋白裂解緩沖液（含protease inhibitor Cocktail），提取腦組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總量，以GAPDH作為內(nèi)參，檢測腦組織Bcl-2、Bax、Caspase3、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2 和 p-ERK1/2蛋白相對表達情況，Tanon軟件采集圖像并進行灰度分析。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 各組大鼠MACO術后神經(jīng)功能損傷得分比較（分，±s）

表1 各組大鼠MACO術后神經(jīng)功能損傷得分比較（分，±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 TPA組比較，&P＜0.05；與尼莫地平組比較，◇P＜0.05。 下同

組 別 n假手術組 1 0模型組 1 0 T P A組 1 0神經(jīng)功能損傷得分0.2 3±0.0 4 2.6 8±0.5 4*2.5 2±0.4 9*尼莫地平組 1 0 1.4 9±0.2 7#*&S H C 組 1 0 1.5 1±0.3 0#*&

2 結 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷得分［6］比較 見表1。與假手術組比較，模型組、TPA組、尼莫地平組、SHC組大鼠神經(jīng)功能損傷得分顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，SHC組、尼莫地平組大鼠神經(jīng)功能損傷得分明顯降低（P＜0.05），TPA組大鼠神經(jīng)功能損傷得分無明顯變化（P＞0.05）；與TPA組比較，尼莫地平組、SHC組大鼠神經(jīng)功能損傷得分均明顯降低（P＜0.05）；尼莫地平組和SHC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織梗死體積的比較 見圖1、表2。與假手術組比較，模型組、TPA組、尼莫地平組、SHC組大鼠腦梗死體積顯著增加 （P＜0.05）；與模型組比較，SHC組、尼莫地平組大鼠腦梗死體積明顯降低（P＜0.05），TPA組大鼠腦梗死體積無明顯變化 （P＞0.05）；與TPA組比較，尼莫地平組、SHC組大鼠腦梗死體積均明顯降低（P＜0.05）；尼莫地平組和SHC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色結果

表2 各組大鼠MACO術后腦梗死體積結果比較（±s）

表2 各組大鼠MACO術后腦梗死體積結果比較（±s）

組 別 n假手術組 1 0模型組 1 0 T P A組 1 0腦梗死體積（%）1.0 4±0.0 5 5 2.6 8±9.3 4*4 9.7 8±9.3 1*尼莫地平組 1 0 1 8.2 7±3.2 6#*&S H C 組 1 0 1 9.0 3±3.6 8#*&

2.3 各組大鼠海馬組織病理變化比較 見圖2。與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織細胞排列紊亂，神經(jīng)元細胞萎縮，胞間縫隙增大，出現(xiàn)空泡。與模型組比較，SHC組、尼莫地平組能有效減輕海馬組織病理變化。與SHC組比較，TPA組大鼠病理變化相對明顯。

2.4 各組大鼠神經(jīng)細胞凋亡情況的比較 見圖3、表3。與假手術組比較，模型組、TPA組、尼莫地平組、SHC組神經(jīng)細胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，SHC組、尼莫地平組大鼠神經(jīng)細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），TPA組大鼠神經(jīng)細胞凋亡率無明顯變化（P＞0.05）；與TPA組比較，尼莫地平組、SHC組大鼠神經(jīng)細胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05）；尼莫地平組和SHC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠海馬組織病理變化（HE染色，200倍）

圖3 各組大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響

表3 各組大鼠MACO術后神經(jīng)細胞凋亡結果比較（%，±s）

表3 各組大鼠MACO術后神經(jīng)細胞凋亡結果比較（%，±s）

組 別 n假手術組 1 0模型組 1 0 T P A組 1 0凋亡率7.3 8±1.8 5 7 2.4 8±1 3.8 7*6 6.7 7±1 3.2 1*尼莫地平組 1 0 3 5.2 4±5.9 5#*&S H C 組 1 0 3 3.3 5±4.8 9#*&

2.5 各組大鼠Caspase3凋亡通路蛋白表達的比較見圖4、表4。與假手術組比較，模型組、TPA組、尼莫地平組、SHC組Bax、Caspase3蛋白表達明顯上調(diào) （P＜0.05），尼莫地平組、SHC組Bcl-2蛋白表達明顯上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，TPA 組、SHC 組、尼莫地平組大鼠Caspase3蛋白表達顯著下調(diào) （P＜0.05），SHC組、尼莫地平組大鼠Bax蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05），SHC組、尼莫地平組、TPA組Bcl-2顯著上調(diào)（P＜0.05）；與TPA組比較，尼莫地平組、SHC組Bax、Caspase3蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.05），Bcl-2 顯著上調(diào)（P＜0.05），尼莫地平組和SHC組Caspase3蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠Bax、Caspase3、Bcl-2蛋白的表達

表4 各組大鼠腦組織Bax、Caspase3、Bcl-2蛋白表達的比較（±s）

表4 各組大鼠腦組織Bax、Caspase3、Bcl-2蛋白表達的比較（±s）

組別 n假手術組 1 0模型組 1 0 T P A組 1 0尼莫地平組 1 0 S H C組 1 0 c a s p a s e 3/G A P D H B a x/G A P D H B c l-2/G A P D H 0.8 3±0.1 2 0.6 3±0.1 1 0.2 8±0.1 1 2.8 5±0.4 1* 2.1 7±0.2 6* 0.2 6±0.0 2 2.2 3±0.1 1*# 2.1 9±0.1 8* 0.3 5±0.0 6#1.1 7±0.1 5*#& 1.3 2±0.1 9*#& 0.6 9±0.1 3*#&1.6 3±0.0 5*#&◇ 1.1 5±0.1 2*#& 0.7 8±0.1 2*#&

2.6 各組大鼠MAPK/ERK信號通路蛋白表達比較見圖5及表5。各組MEK1/2、ERK1/2蛋白的表達情況比較差異均無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；與假手術組比較，模型組、TPA組、SHC組p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達明顯上調(diào)（P＜0.05），尼莫地平組p-ERK1/2蛋白表達明顯上調(diào) （P＜0.05），p-ERK1/2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與模型組、TPA 組比較，SHC組、尼莫地平組p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05）；尼莫地平組與SHC組大鼠p-MEK1/2、p-ERK1/2 蛋白表達無明顯差異（P＞0.05）。

3 討 論

缺血/再灌注損傷指缺血一段時間恢復供血時，發(fā)生嚴重組織損傷及機能障礙，是某些疾病致死的重要原因［8］，其中腦缺血/再灌注損傷是防治重點。近年來我國腦卒中雖致死率有所降低，但仍嚴重威脅我國居民生命健康［9］。參芎化瘀膠囊由石菖蒲、人參、川芎、地鱉蟲、乳香、紫河車、沒藥、全蝎、龍血竭、五味子、郁金、桑椹子等組成，石菖蒲具有醒神健腦之功效，人參、紫河車可補氣血，川芎、乳香、沒藥可活血行氣，桑椹子可養(yǎng)血健脾，郁金、五味子可行氣解郁、寧心安神，諸藥合用可養(yǎng)血益氣，化瘀通絡。趙雅寧等發(fā)現(xiàn)，參芎化瘀膠囊能通過增加PI3-K/Akt信號活化保護小鼠腦缺血損傷［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，參芎化瘀膠囊可明顯減輕腦缺血/再灌注所致神經(jīng)功能障礙，降低腦梗死體積，減輕腦組織病理損傷、降低神經(jīng)細胞凋亡率，提示參芎化瘀膠囊對腦缺血/再灌注所致神經(jīng)損傷具有保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，參芎化瘀膠囊對腦缺血/再灌注損傷的保護作用可被MAPK/ERK信號通路激活劑TPA特異性地逆轉，提示參芎化瘀膠囊對腦缺血/再灌注損傷的保護作用與MAPK/ERK信號通路有關。

圖5 各組大鼠 MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表達

表5 各組大鼠 MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達的比較（±s）

表5 各組大鼠 MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達的比較（±s）

組 別 n假手術組 1 0模型組 1 0 T P A組 1 0尼莫地平組 1 0 S H C組 1 0 p-M E K 1/2/G A P D H E R K 1/2/G A P D H 0.4 3±0.0 7 1.1 9±0.1 7 1.0 9±0.1 2* 1.2 4±0.2 1 0.9 5±0.2 0* 1.2 3±0.1 8 0.4 9±0.1 1#& 1.2 1±0.1 7 0.5 6±0.1 1*#& 1.2 2±0.2 0 M E K 1/2/G A P D H p-E R K 1/2/G A P D H 1.1 3±0.0 9 0.5 3±0.0 8 1.1 2±0.0 8 1.4 9±0.1 1*1.1 6±0.1 5 1.4 5±0.1 2*1.1 5±0.1 4 0.8 7±0.1 1*#&1.1 5±0.1 2 0.8 9±0.1 0*#&

細胞凋亡是缺血/再灌注損傷造成腦組織細胞死亡的主要原因，在腦I/R損傷過程中發(fā)揮著重要作用［11］。Bcl-2家族包括B淋巴細胞瘤-2蛋白（Bcl-2）等抑凋亡成員和Bcl-2相關X蛋白 （Bax）等促凋亡成員［12］。正常情況下，Bax與Bcl-2和Bcl-XL形成二聚體可阻止細胞凋亡發(fā)生；受到凋亡刺激時，Bax蛋白表達增加，促使Bax-Bax同二聚體在線粒體膜上形成，促使線粒體膜通透性增加，使得AIF、細胞色素C等凋亡因子進入細胞質中，激活Caspase級聯(lián)反應而誘發(fā)細胞凋亡［13］。樓燁亮等發(fā)現(xiàn)，哈巴苷可通過抑制caspase依賴性凋亡通路抑制急性腦缺血所致小鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，SHC組神經(jīng)細胞凋亡率明顯降低。Western結果顯示，模型組Bax、Caspase3蛋白表達明顯上調(diào)，Bcl-2蛋白表達無明顯變化；與模型組比較，SHC組Bax、Caspase3蛋白表達下調(diào)、Bcl-2蛋白表達上調(diào)。提示參芎化瘀膠囊能抑制Caspase3凋亡通路激活。進一步研究發(fā)現(xiàn)，參芎化瘀膠囊對腦缺血/再灌注所致神經(jīng)細胞凋亡的保護作用可被TPA逆轉，提示參芎化瘀膠囊對腦缺血/再灌注損傷所致細胞凋亡的保護作用與MAPK/ERK通路有關。

MAPK/ERK通路是由激酶級聯(lián)反應介導的信號傳導通路，通過一系列級聯(lián)反應激活靶基因轉錄，參與細胞增殖、凋亡等生理病理過程［15］。研究表明，MAPK/ERK通路異常激活與心肌缺血再灌注損傷等疾病相關［16］。劉斌等發(fā)現(xiàn)，參芎化瘀膠囊可通過上調(diào)BDNF表達，促進血管性癡呆大鼠損傷神經(jīng)元的修復［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注損傷后，大鼠腦組織MEK1/2、ERK1/2蛋白總表達無明顯變化，但p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達明顯上調(diào)；參芎化瘀膠囊治療后，p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達顯著下調(diào)，對MEK1/2、ERK1/2蛋白總量沒有影響，說明參芎化瘀膠囊具備激活MAPK/ERK信號通路的可能。進一步研究發(fā)現(xiàn)，參芎化瘀膠囊下調(diào)p-MEK1/2、p-ERK1/2表達的作用被TPA逆轉，提示參芎化瘀膠囊可能通過抑制MAPK/ERK信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，參芎化瘀膠囊可能通過抑制MAPK/ERK信號通路進而抑制Caspase3凋亡通路，發(fā)揮對腦缺血/再灌注所致神經(jīng)損傷的保護作用。