針刺對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血管緊張素Ⅱ及其受體1以及γ-氨基丁酸的影響*

董愛愛 郭繼龍 崔依依 冀雨芳 李上慶 劉高峰 來曉云 董 琦 冀來喜△

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030600；3.山東省淄博市張店區(qū)中醫(yī)院，山東 淄博 255035；4.山西省中醫(yī)藥研究院，山西 030012）

原發(fā)性高血壓（EH）是腦血管疾病的高危因素，自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）模型因可高度模擬人高血壓的形成及發(fā)展過程，且適于降壓方案的篩選，一直是眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。EH病理進(jìn)展及其所致的心腦腎靶器官受損與高 RAS 活性［1］和高交感神經(jīng)興奮性［2］密切相關(guān)。經(jīng)典的RAS主要由腎素原（AGT）、腎素、ACE、血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）及其相應(yīng)的受體組成。循環(huán)中的AGT在腎素的作用下轉(zhuǎn)變成AngⅠ，AngⅠ在ACE的作用下水解為AngⅡ，后者進(jìn)而水解為AngⅢ，但因AngⅠ、AngⅢ的代謝清除率較高，因此在 RAS 中仍是 AngⅡ起主要作用［3］。AT1 受體（AT1R）介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)較AT2受體強(qiáng)，其可收縮血管、刺激醛固酮釋放，進(jìn)而改變血壓、影響水/電解質(zhì)平衡［4］。外周RAS受中樞調(diào)控，中樞RAS系統(tǒng)活性與交感神經(jīng)活動(dòng)聯(lián)系密切［5］，中樞交感輸出的最終共同通路［6］在延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（RVLM）區(qū)，且該區(qū)活動(dòng)受到GABA的調(diào)節(jié)［7］?；诖思凹韧n題組針穴降壓研究［8］基礎(chǔ)，本研究討論針刺對(duì) SHR延髓、腎臟 AngⅡ、AT1R及交感樞紐RVLM區(qū)GABA的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用16周雄性Wistar大鼠15只，體質(zhì)量250～290 g。 SHR大鼠 30只，體質(zhì)量 280～310 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-17。飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué) SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試藥與儀器 BP-600A全自動(dòng)大小鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)，成都泰盟軟件有限公司產(chǎn)品；Bio-RAD 680酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂公司產(chǎn)品。兔多克隆抗AT1抗體（博士德ZP1974BP74）；兔多克隆抗GABA抗體（博奧森bs-2252R）；博士德山羊抗兔IgG、卵白素-生物素結(jié)合物（SABC）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）。

1.3 動(dòng)物分組 30只SHR大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為SHR組、針刺組各15只。15只WKY大鼠設(shè)為WKY組作為對(duì)照組。

1.4 干預(yù)方法 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始干預(yù)。針刺組取雙側(cè)人迎、曲池、足三里穴治療，留針20 min。每日1次，每治療 6 d，休息 1 d；療程 8周，共治療 48次。WKY組、SHR組和針刺組采用自制鼠板行相同時(shí)間、相同程度的捆綁固定，并于針刺治療結(jié)束后解除固定。每日自由食水，取材前1 d禁食水。

1.5 標(biāo)本采集 大鼠行水合氯醛300 mg/kg，腹腔注射麻醉。眼眶采血2 mL，離心血清備用。于左側(cè)腎門處止血鉗夾閉腎動(dòng)靜脈，迅速摘取左腎，將其上極腎皮質(zhì)游離出來，按質(zhì)量（g）∶容積（mL）＝1∶9 比例加入冰 0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行勻漿，5000 r/min離心15 min取組織上清待測(cè)；將余左腎冠狀切取5 mm厚，于4%多聚甲醛中4℃固定。經(jīng)左心灌流0.9%氯化鈉注射液150 mL，冰臺(tái)操作迅速取腦，去除小腦，取Obex點(diǎn)以上延髓及大腦，參照Paxinos&Watson大鼠腦圖譜可定位 RVLM［9］，并將固定完的腦組織置于大鼠腦模具上選擇包含RVLM的延髓段（第十二對(duì)腦神經(jīng)頭側(cè)第一分支前 0.6～1.0 mm，中線旁開 1.7～1.9 mm，腹側(cè)表面下0.5～0.8 mm）。針頭吸取左側(cè)RVLM區(qū)組織，勻漿（同腎組織）備測(cè)，剩余延髓RVLM層面腦片于4%多聚甲醛中固定。組織固定36 h后，按常規(guī)制備石蠟包埋切片，連續(xù)切片厚3 μm。按各指標(biāo)5張腦片留取備檢。

1.6 免疫組化和圖像分析 采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色（ABC法），石蠟切片，經(jīng)二甲苯、梯度（由高至低）酒精依次脫蠟至水。3%H2O2（PBS配）15min去除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，高壓鍋15 min熱抗原修復(fù)，羊血清37℃孵育30 min以去除非特異性染色。AT1R抗體（稀釋 1∶100）、GABA 抗體（稀釋 1∶400），加一抗后于4℃過夜；加入二抗山羊抗兔IgG于37℃孵育30 min；再加SABC（卵白素-生物素結(jié)合物）37℃孵育30 min；最后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB，博士德）顯色，蘇木素復(fù)染核30 s。用非免疫兔血清IgG（1∶5）代替一抗作陰性對(duì)照，未觀察到陽(yáng)性表達(dá)。用Image pro plus圖像軟件計(jì)算AT1R、GABA免疫組化陽(yáng)性表達(dá)平均光密度（MOD）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用IBM SPSS Statistics 22統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，各組間各指標(biāo)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠收縮壓及舒張壓比較 見表1。SHR組大鼠血壓明顯高于WKY組，針刺組血壓顯著低于SHR 組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血壓比較（mmHg，±s）

表1 各組大鼠血壓比較（mmHg，±s）

與 WKY 組比較，*P＜0.05；與 SHR 組比較，△P＜0.05；與針刺組比較，#P＜0.05。 下同

組別 n D B P S B P W K Y 組 1 5 9 8.0 9±2 3.3 0△ 1 1 8.2 5±6.2 8△S H R 組 1 5 1 4 0.7 5±1 4.1 3*# 1 6 5.7 5±9.0 6*#針刺組 1 5 1 2 5.9 1±1 2.5 8△ 1 5 1.7 9±7.9 4△

2.2 各組大鼠血清、腎、延髓左側(cè)RVLM區(qū)AngⅡ水平比較 見表2。SHR大鼠血清、腎和延髓左側(cè)RVLM區(qū)勻漿AngⅡ明顯高于WKY組（P＜0.05）；針刺組腎和腦組織勻漿AngⅡ顯著低于SHR組（P＜0.05），而血清 AngⅡ無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清、腎和延髓左側(cè)RVLM區(qū)勻漿AngⅡ比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠血清、腎和延髓左側(cè)RVLM區(qū)勻漿AngⅡ比較（pg/mL，±s）

組 別 腎 延髓R V L M區(qū)W K Y 組 1 9 7.3 6±3 7.8 3△ 2 8 7.4 2±4 1.2 6△n 血清1 5 3 5 4.4 5±2 9.1 5△S H R 組 4 4 5.6 3±5 2.3 3*#5 2 6.1 5±6 5.8 3*#1 5 6 9 8.5 2±3 7.2 8*針刺組 1 5 6 4 2.9 4±2 9.8 3 3 3 5.2 6±4 9.5 8△ 3 9 2.4 6±4 3.6 4△

2.3 各組腎臟AT1R、延髓右側(cè)RVLM區(qū)AT1、GABA表達(dá) 見表3，圖1，圖2。SHR組的腎臟、延髓右側(cè)RVLM區(qū)AT1R分布的MOD值顯著高于WKY組（P＜0.05），GABA表達(dá)結(jié)果則是前者低于后者 （P＜0.05）。與SHR組相比，針刺組AT1R表達(dá)降低，GABA表達(dá)升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腎臟AT1R、延髓右側(cè)RVLM區(qū)AT1R與GABA 比較（MOD，±s）

表3 各組大鼠腎臟AT1R、延髓右側(cè)RVLM區(qū)AT1R與GABA 比較（MOD，±s）

?組 別 R V L M區(qū)A T 1 R R V L M區(qū)G A B A W K Y 組 0.2 1 8±0.0 3 1△ 0.3 4 9±0.0 3 6△n 腎A T 1 R 1 5 0.1 4 4 ±0.0 2 2△S H R 組 0.4 8 5±0.0 8 3*# 0.1 6 8±0.0 4 5*#1 5 0.5 9 1±0.1 8 7*#針刺組 1 5 0.3 7 9±0.0 5 7△ 0.3 4 1±0.0 4 6△ 0.2 0 2±0.0 2 8△

圖1 各組大鼠腎免疫組化AT1R表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)染色ABC法，400倍）

圖2 各組延髓RVLM區(qū)免疫組化AT1R及GABA表達(dá)（免疫細(xì)胞化學(xué)染色ABC法，200倍）

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)表明針刺能明顯降低SHR大鼠的血壓。降壓效應(yīng)指標(biāo)比較顯示，血漿AngⅡ水平遠(yuǎn)高于腎組織，這與龍海波等［10］研究結(jié)果一致。因腎臟局部依靠自分泌/旁分泌系統(tǒng)及腦組織血腦屏障的特殊存在，腎［11］和腦［12］的RAS活性均可獨(dú)立于循環(huán)調(diào)控。腎組織中AngⅡ水平與腎小球、腎小管內(nèi)皮細(xì)胞等部位AT1R的表達(dá)呈正相關(guān)，本研究亦得出SHR組腎、延髓AngⅡ水平及AT1R表達(dá)較WKY組一致性升高。

與WKY組比較，SHR組腎臟AT1R表達(dá)（MOD）顯著增加，且存在腎小動(dòng)脈管壁增生、腎小球基底膜皺縮、球囊間隙增寬、腎小球固縮等明顯的高血壓靶器官損傷病理改變。針刺治療組腎損害減輕，腎小球固縮發(fā)生較少，球囊間隙增寬不明顯。因此針刺治療能部分緩解腎小球萎縮，AT1R陽(yáng)性表達(dá)明顯低于模型組，可為針刺降壓及腎保護(hù)作用提供線索。腎臟局部的AngⅡ可以直接與近端腎小管AT1R相結(jié)合，導(dǎo)致腎臟高血壓、高灌注、高濾過等損傷。有研究表明［4］AngⅡ可以促進(jìn)腎小球臟層細(xì)胞肥大，使足突增寬，纖連蛋白合成增加。

本研究表明給予針刺治療后，腎臟的AngⅡ水平低于SHR組，而對(duì)血清中的AngⅡ作用不明顯；說明針刺能使腎臟AngⅡ合成減少，與AT1R結(jié)合發(fā)揮的效應(yīng)被抑制。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)針刺組與模型組血清AngⅡ的差異，推測(cè)受到AT1R降低后代償性AngⅡ升高等混雜因素影響。研究表明［13］，AT1R被阻斷的情況下，機(jī)體內(nèi)AngⅡ雖然會(huì)代償性升高，但并不能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)；相反，更多的AngⅡ經(jīng)由Ang1-7及AT2R途徑發(fā)揮降壓效應(yīng)。另有研究發(fā)現(xiàn)［3］，腎臟局部產(chǎn)生的AngⅡ，部分可隨尿排出；但因循環(huán)中的AngⅡ亦可通過腎小球?yàn)V過膜而重吸收，因此血循環(huán)及尿中AngⅡ水平不能反映腎臟局部的RAS活性，但腎內(nèi)的AngⅡ濃度與腎臟硬化呈正相關(guān)。這為本研究結(jié)果—針刺治療降低腎組織AngⅡ水平及AT1R陽(yáng)性表達(dá)并能部分緩解腎小球萎縮提供了理論基礎(chǔ)。

針刺組較SHR組延髓RVLM區(qū)AngⅡ、AT1R降低而GABA則升高，提示SHR組GABA能神經(jīng)元功能降低，對(duì)RVLM區(qū)交感活動(dòng)的內(nèi)源性抑制作用減弱。另外SHR組增多的AT1R，可作用于α1腎上腺素受體從而促進(jìn)交感神經(jīng)元興奮，研究表明AngⅡ、AT1R與谷氨酸受體［14］密切相關(guān)，共同參與調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性。腦組織AT1R表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元內(nèi)，GABA主要由神經(jīng)元內(nèi)的谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶（GAD）脫羧而成［15］，主要儲(chǔ)存于胞漿內(nèi)。 AT1R 分布集中在血管、心、腦及腎中，介導(dǎo)AngⅡ的大部分生物學(xué)效應(yīng)，引起血管收縮及靶器官損害。GABA作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)可抑制升壓神經(jīng)元，這種緊張性抑制作用在SHR大鼠較正常血壓大鼠明顯減弱［16］。AT1R和GABA有共同［17］的下游通路——鈣離子依賴的PKC路徑來調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化。

本實(shí)驗(yàn)得出，與Wistar大鼠相比，SHR大鼠的RVLM區(qū)AT1受體MOD明顯較高，而同區(qū)域GABA受體MOD明顯偏低，因此我們推測(cè)RVLM區(qū)細(xì)胞表面的AT1R、GABA受體密度差異可能是SHR對(duì)AngⅡ刺激反應(yīng)性提高及血壓升高的主要因素。研究表明［18］AngⅡ亦可影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，可激活RVLM區(qū)GABA能神經(jīng)元末端的AT1R，通過G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)Gi/Go蛋白通路、NADPH-ROS氧化應(yīng)激路徑，抑制神經(jīng)突觸末端GABA的釋放，降低GABA受體的活性。本研究表明針刺能部分逆轉(zhuǎn)SHR大鼠RVLM區(qū)AngⅡ高水平及AT1R高表達(dá)，并調(diào)高GABA表達(dá)水平。RVLM為重要的交感神經(jīng)通路核團(tuán)［19］，能整合動(dòng)脈壓力感受器的神經(jīng)傳入及GABA能神經(jīng)元的抑制性中轉(zhuǎn)信號(hào)。

針刺降壓作用確切，機(jī)制研究頗多。Ohsawa H等［20］通過針刺大鼠后肢足三里穴，觀察到平均動(dòng)脈壓下降和腎交感神經(jīng)活性下降，而切斷同側(cè)坐骨神經(jīng)或股神經(jīng)，該效應(yīng)消失；并發(fā)現(xiàn)肢體傳入纖維與腦干胃迷走傳出節(jié)前神經(jīng)元的功能聯(lián)系比腹部傳入纖維要強(qiáng)。另外一項(xiàng)針刺對(duì)迷走和交感神經(jīng)影響的實(shí)驗(yàn)研究［21］表明，以麥角胺阻滯交感神經(jīng)節(jié)后纖維，針刺足三里穴引起的迷走神經(jīng)作用消失，說明迷走神經(jīng)是“足三里”針效的必要傳出途徑，又必須在交感神經(jīng)存在的情況下才能發(fā)生。我們認(rèn)為針刺足三里穴興奮迷走神經(jīng)能拮抗交感神經(jīng)作用，從而抑制交感興奮引起的血壓升高。這也是本實(shí)驗(yàn)針刺曲池、足三里穴降壓的理論依據(jù)。針刺人迎穴可通過刺激穴下交感神經(jīng)干和迷走神經(jīng)，起到調(diào)整自主神經(jīng)功能從而降壓的作用［22］。 安娜等［23］研究亦顯示針刺人迎穴可以通過影響5-HT1A等抑制交感神經(jīng)活性，改變感覺信息傳遞，從而降壓。基于上述針刺穴位的神經(jīng)理論基礎(chǔ)及本研究結(jié)果，提示針刺人迎、曲池、足三里穴可以提高RVLM區(qū)GABA的表達(dá)，降低腎組織AngⅡ、AT1R水平，抑制RAS系統(tǒng)及交感神經(jīng)傳出從而降壓。