上皮鈉離子通道阻滯劑阿米洛利對雌性大鼠骨代謝的影響

張延嬌 陳 博

(廣東醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理科學實驗室，廣東 東莞 523808)

雌激素在維持雌性骨代謝平衡中起重要作用。研究證實雌激素的生物學功能主要由雌激素受體(ER)介導，而骨細胞上的ER數(shù)量很少，且雌激素與ER的結合率也很低〔1～3〕。雌激素在體內(nèi)的代謝除雌激素經(jīng)典途徑，還存在替代通路〔4～6〕，目前雌激素影響骨代謝的機制尚未完全闡明。離子通道是細胞間相互通信和傳送電信號的便利途徑。上皮鈉離子通道(ENaC)具有多方面的生理功能，包括酸感受、維持鈉平衡和感應傳導機械應力刺激。研究表明ENaC表達存在性別差異，雌激素能調節(jié)和影響腎臟、肺、子宮等器官鈉通道蛋白或ENaC亞單位基因表達〔7～9〕，并影響ENaC生理作用(如子宮水鈉潴留，血壓等)。ENaC在成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞上都有分布。研究證實ENaC參與骨代謝，在成骨細胞中ENaC參與雌激素促進骨形成過程，雌激素的促成骨作用能被ENaC阻滯劑阿米洛利(Ami)抑制〔10〕。Ami處理破骨細胞后，細胞上ENaC表達減弱，同時抑制破骨細胞的形成，表明ENaC影響骨吸收〔11,12〕。本文探討ENaC受體阻滯劑Ami對不同雌激素水平下骨代謝的影響。

1 材料和方法

1.1試驗動物 3月齡雌性SD大鼠〔廣東省南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(粵)2011-0015〕40只，SPF級，體重160～180 g。適應性喂養(yǎng)1 w后開始實驗。

1.2試驗藥品與試劑 鹽酸Ami(純品)粉劑；堿性磷酸酶試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；N端骨鈣素(N-MID)(100T)檢測試劑盒(德國羅氏，批號：17233501)；CalsetN-MID定標液(L&H，德國羅氏，批號：17225901)；雌二醇(E2)(100T)檢測試劑盒(德國羅氏，批號：17207803)；CalsetE2定標液(德國羅氏，批號：17286601)。

1.3動物造模與分組 隨機數(shù)表法將大鼠分成5組，每組8只，分別為基礎對照組、假手術組、假手術組+Ami組、去卵巢組、去卵巢+Ami組?；A對照組適應性喂養(yǎng)后，于實驗初始時處死取材。實驗中以2‰羧甲基纖維素鈉作為助懸劑。假手術+Ami組和去卵巢組+Ami組Ami給藥劑量為10 mg·kg-1·d-1，假手術組和去卵巢組給等體積2‰羧甲基纖維素鈉溶液，灌胃給藥8 w。

1.4實驗方法 各組每7 d稱重1次，以測定時間為橫坐標，體重為縱坐標，繪制生長曲線。應用堿性磷酸酶(ALP)試劑盒測ALP，N-MID、E2采用電化學發(fā)光法測定，具體步驟按說明書操作。處理好的股骨標本沿長軸垂直固定于樣品固定器內(nèi)。vivaCT 40選擇掃描參數(shù)：圖像矩陣為1 024×1 024，能量/強度為70 kVp、114 μA、8 W。選取距生長板遠端1.0 mm、層厚3.0 mm的骨組織為感興趣區(qū)域行三維重組，獲得重組圖像后使用micro-CT自帶軟件定量分析。

1.5統(tǒng)計方法 采用SPSS13.0軟件進行正態(tài)分布檢驗、非參數(shù)檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1ENaC阻滯劑Ami對雌性大鼠體重的影響 與假手術組比較，大鼠去卵巢2 w后體重呈顯著性增加(P<0.05，P<0.01)。而假手術組和假手術+Ami組體重僅表現(xiàn)出正常增長。Ami對體重無影響。見表1。

表1 各組體重比較

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01;3)因操作失誤1只大鼠死亡

2.2鹽酸Ami對骨量的影響 與基礎對照組比較：假手術組骨體積(BV)、骨總量(TV)顯著增加(P<0.01)，骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著性降低(P<0.05)，表明隨著實驗進程股骨在生長。與假手術組比較：去卵巢組BV、BV/TV、骨小梁數(shù)量(Tb.N)明顯降低，Tb.Sp明顯增高(P<0.01)，提示生長期大鼠去卵巢2個月能夠成功建立骨質疏松模型；假手術+Ami組BV明顯增加(P<0.01)，BV/TV、Tb.N、Tb.Th均增高，而Tb.Sp降低，且差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示Ami對正常大鼠骨量無影響。與去卵巢組比較，去卵巢+Ami組BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均顯著降低(P<0.01)，而TV、Tb.Sp顯著增高(P<0.05，P<0.01)，提示Ami加劇去卵巢大鼠的骨丟失。見表2、圖1、2。

表2 各組骨量比較

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與去卵巢組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；5)因操作失誤1只大鼠死亡；下表同

圖1 各組microCT股骨下段的三維重建

圖2 各組microCT股骨下段縱切面

2.3鹽酸Ami對血清激素的影響 與假手術組比較：基礎對照組血清E2、ALP、N-MID水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，去卵巢組和去卵巢+Ami組血清E2水平顯著性下降(P<0.05，P<0.01)，N-MID顯著增高(P<0.05)。表現(xiàn)出高骨轉換過程中骨形成活躍。見表3。

表3 各組血清激素水平比較

3 討 論

絕經(jīng)后骨質疏松主要是雌激素水平下降導致骨吸收和骨形成失去動態(tài)平衡而出現(xiàn)的代謝性骨病，屬于老年病范疇。ENaC是許多藥物作用的靶點，受多種激素和藥物調節(jié)〔10〕。體外實驗證實，雌激素促進成骨細胞增殖和成骨相關基因表達，同時上調ENaC mRNA表達,應用LNaC阻滯劑能阻斷雌激素的促成骨作用，提示ENaC參與雌激素調節(jié)下成骨作用〔9〕。ENaC也參與調控破骨細胞分化和骨吸收過程〔12〕，在關節(jié)炎和骨質疏松的發(fā)病過程中起作用，可能是防治骨質疏松的新靶點。

Ami是臨床應用的一種保鉀利尿劑，可以抑制鈉離子通道、質子通道、一些鈉離子相關轉運體(Na+-H+反向轉運體、Na+-Ca2+交換體)等多個離子通道。Ami常常作為非特異性鈉離子通道阻滯劑，在基礎研究中,也常作為一種藥理學工具被廣泛應用。體外對破骨細胞實驗證實，Ami能夠抑制破骨細胞內(nèi)ENaC表達，抑制破骨細胞的分化和骨吸收；同時也有實驗表明Ami能抑制雌激素的促成骨作用〔10,12〕。骨代謝是骨形成和吸收相互耦聯(lián)的動態(tài)過程，本實驗結果表明Ami能加劇去卵巢所致高骨轉換狀態(tài)下的骨丟失，而對假手術組骨量無明顯影響，但實驗中無論假手術大鼠還是去卵巢大鼠，Ami均未表現(xiàn)出對骨形成的影響，推測可能是直接或間接影響骨吸收過程影響骨代謝，尚需進一步實驗證實。