高強(qiáng)度聚焦超聲聯(lián)合竹紅菌素軟膏對(duì)外陰上皮非瘤樣病變組織中P16、CD34的影響*

張憲軍，陳志紅，李明，李桂芬，宋永禎

（河北省衡水市人民醫(yī)院 1.婦科，2.內(nèi)科，河北 衡水 053000）

女性外陰處皮膚出現(xiàn)異常色素沉淀或黏膜組織變性被稱為外陰上皮內(nèi)非瘤樣病變（non neoplastic intraepithelial lesions of vulva, NNED）[1]。 目前，對(duì)NNED的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)明確的認(rèn)知，可能與患者局部微循環(huán)缺陷、細(xì)胞周期異常有關(guān)[2]。高強(qiáng)度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound, HIFU）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型無(wú)創(chuàng)NNED治療手段，具有操作簡(jiǎn)單，對(duì)機(jī)體幾乎無(wú)創(chuàng)傷，療效顯著等特點(diǎn)[3-4]。竹紅菌素軟膏是一種涂抹于外陰處皮膚的外用藥物，具有抑菌作用[5]。臨床研究認(rèn)為，兩者聯(lián)合運(yùn)用對(duì)NNED的治療具有顯著效果。目前，普遍認(rèn)為NNED的發(fā)生與細(xì)胞周期失調(diào)和微循環(huán)障礙有關(guān)。P16蛋白是參與抑癌基因調(diào)控和細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，CD34是高特異性血管內(nèi)皮標(biāo)志物[6-7]。這兩種蛋白在NNED的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。本研究對(duì)比HIFU單獨(dú)治療和聯(lián)合治療對(duì)患者病變組織中P16和CD34蛋白表達(dá)水平的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年12月-2015年12月在該院進(jìn)行治療的80例NNED患者為研究對(duì)象。其中，2013年12月以前入院的40例患者作為對(duì)照組，選擇2013年12月以后入院與其狀況相似的40例患者作為觀察組。對(duì)照組：年齡18～59歲，平均（43.6±4.1）歲；平均病程（4.3±0.6）年；硬化性苔蘚型（lichen sclerosis, LSV）6例、鱗狀上皮細(xì)胞增生型（squamous hyperplasia, SHV）30例、合并型（lichen sclerosis combined with squamous hyperplasia, LSCSH）4例。觀察組：年齡20～62歲，平均（44.9±3.2）歲；平均病程（4.1±0.8）年；LSV型4例、SHV型33例、LSCSH型3例。

經(jīng)檢驗(yàn)，兩組患者年齡、病程、病理分型等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均對(duì)研究?jī)?nèi)容知情同意并簽署知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有入選患者均接受過(guò)其他治療，但出現(xiàn)復(fù)發(fā)；②年齡＜65周歲，＞18周歲；③患者治療依從性好；④自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病變組織進(jìn)行病理學(xué)檢查顯示為外陰癌和不典型增生者；②經(jīng)期患者；③陰道急性炎患者；④存在心臟病、糖尿病、甲亢和惡性腫瘤患者；⑤對(duì)治療所用藥物過(guò)敏者。

1.2 研究方法

所有患者均接受HIFU治療。采用CAF型聚焦超聲治療儀（購(gòu)自重慶海扶技術(shù)有限公司）進(jìn)行治療?；颊呤紫热〗厥?，功率3.7 W，頻率9.5 MHz，治療范圍為病變區(qū)及其外0.5 cm，速度為3～5 mm/s。探頭對(duì)準(zhǔn)目標(biāo)治療區(qū)域緊貼病變皮膚進(jìn)行連續(xù)的直線掃描，控制掃描速率為2～3 mm/s，可根據(jù)患者自身病變區(qū)域大小和嚴(yán)重程度靈活調(diào)整治療時(shí)間，治療時(shí)間最少15 min，最長(zhǎng)不得超過(guò)50 min。每3次治療為1個(gè)療程，每次治療之間間隔2周，所有患者均接受2個(gè)療程的治療。

在此基礎(chǔ)上，觀察組患者還接受竹紅菌素軟膏治療。觀察組患者進(jìn)行HIFU治療時(shí)，將5 g竹紅菌素軟膏與超聲專用傳導(dǎo)介質(zhì)耦合劑混合，并涂抹到目標(biāo)治療區(qū)域，而后進(jìn)行超聲治療。

1.3 觀察指標(biāo)

療效評(píng)價(jià)：參考武愛(ài)芳等[8]建立的“外陰瘙癢評(píng)分法”“四度皮膚彈性評(píng)估法”“外陰白色病變面積計(jì)算法”，對(duì)治療前和治療2個(gè)療程結(jié)束后6個(gè)月患者外陰患處皮膚進(jìn)行評(píng)價(jià)，以數(shù)字得分來(lái)表示患處皮膚狀態(tài)，得分越低分別表示患處皮膚瘙癢程度低、皮膚富有彈性和病變面積小。

組織P16蛋白和CD34蛋白水平檢測(cè)：采集所有患者治療前病變處皮膚組織，2個(gè)療程治療結(jié)束后6個(gè)月隨訪時(shí)，采集患者相同位置處皮膚組織。同時(shí)，治療前還需要采集所有患者病灶附近健康皮膚組織樣本，作為空白組。采集得到的皮膚組織中加入蛋白裂解液提取蛋白并進(jìn)行Western blot檢測(cè)。采用Image J軟件對(duì)所得蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，設(shè)置空白組目的蛋白的含量為100，計(jì)算對(duì)照組和觀察組目的蛋白的含量相對(duì)值。

觀察治療過(guò)程中兩組患者出現(xiàn)不良反應(yīng)的情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較做差值的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 療效評(píng)價(jià)指標(biāo)比較

患者療效評(píng)價(jià)指標(biāo)比較見(jiàn)表1。治療前兩組患者3項(xiàng)得分經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組患者治療前后3項(xiàng)指標(biāo)得分經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療后3項(xiàng)得分均低于治療前（P＜0.05），但組間比較顯示，觀察組患者治療后3項(xiàng)指標(biāo)得分與對(duì)照組患者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，觀察組患者治療后3項(xiàng)指標(biāo)得分低于對(duì)照組患者（P＜0.05）。

2.2 病變組織P16和CD34蛋白水平比較

治療前兩組患者兩種蛋白表達(dá)經(jīng)t檢驗(yàn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組患者治療前后兩種蛋白表達(dá)經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療后兩組患者P16蛋白水平高于治療前，而CD34蛋白水平低于治療前（P＜0.05）。但組間比較顯示，觀察組患者治療后兩種蛋白表達(dá)與對(duì)照組患者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組患者治療后P16蛋白表達(dá)高于對(duì)照組患者，而CD34蛋白表達(dá)低于對(duì)照組患者。見(jiàn)表2。

表1 NNED患者療效評(píng)價(jià)指標(biāo)比較 （n =40，±s）

表1 NNED患者療效評(píng)價(jià)指標(biāo)比較 （n =40，±s）

外陰瘙癢評(píng)分 四度皮膚彈性評(píng)分 外陰白色病變面積/cm2治療前 治療后 t值 P值 治療前 治療后 t值 P值 治療前 治療后 t值 P值觀察組 2.54±0.22 0.56±0.11 50.912 0.000 2.01±0.54 0.32±0.07 19.629 0.000 12.49±3.57 2.59±0.25 17.496 0.000對(duì)照組 2.55±0.25 1.02±0.23 28.485 0.00 2.07±0.36 0.91±0.05 20.185 0.000 12.35±3.32 5.68±1.02 12.146 0.000 t值 0.190 11.411 0.585 43.378 0.182 18.609 P值 0.850 0.000 0.561 0.000 0.856 0.000組別

表2 病變組織P16和CD34蛋白表達(dá)比較 （n =40，±s）

表2 病變組織P16和CD34蛋白表達(dá)比較 （n =40，±s）

CD34蛋白治療前 治療后 t值 P值 治療前 治療后 t值 P值觀察組 63.29±2.94 86.30±2.40 38.345 0.000 158.39±8.94 119.32±6.04 22.903 0.000對(duì)照組 63.17±2.69 76.49±3.85 17.937 0.000 158.05±8.43 132.10±8.32 13.857 0.000 t值 0.190 13.676 0.175 7.862 P值 0.849 0.000 0.862 0.000 P16蛋白組別

2.3 治療相關(guān)不良反應(yīng)

在治療過(guò)程中，兩組患者均分別出現(xiàn)1例（1/40，2.5%）外陰皮膚淺表性破潰及水泡，經(jīng)對(duì)癥治療后均痊愈，其余患者均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。

3 討論

NNED是一種慢性頑固性病變，患者外陰真皮層出現(xiàn)局部微循環(huán)障礙，真皮層毛細(xì)血管閉塞，膠原蛋白生成受阻，造成真皮內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的退行性病變，進(jìn)而導(dǎo)致黑色素細(xì)胞消失，細(xì)胞變性，皮膚褪色變白等種種臨床癥狀[9]。NNED不僅給患者身心帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)，且研究表明，NNED是外陰癌出現(xiàn)的高危因素，因此，及時(shí)有效的治療NNED十分必要。傳統(tǒng)治療NNED的方法包括藥物、物理和手術(shù)治療，但一直沒(méi)有療效穩(wěn)定確切的標(biāo)準(zhǔn)治療方式。多數(shù)NNED患者經(jīng)過(guò)治療依然出現(xiàn)病情反復(fù)或者疾病復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者病程長(zhǎng)，增加患者心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[10]。

超聲波組織穿透能力強(qiáng)、攜帶能高、局部定位性強(qiáng)，是臨床上用于治療NNED的標(biāo)準(zhǔn)手段，因此，在本研究對(duì)照組患者接受常規(guī)聚焦超聲治療。竹紅菌素可以在光照下被激活，具有抑菌可促循環(huán)作用，已有報(bào)道顯示將兩者合用可有效提高NNED的治療效果，本研究結(jié)果顯示，進(jìn)行聚焦超聲治療的患者，1個(gè)療程后病變處皮膚組織外觀和瘙癢情況都得以極大的改善。這與HIFU的治療機(jī)制有很大關(guān)系，HIFU有很強(qiáng)的組織穿透性，通過(guò)將聲波能量聚集在較小的皮膚面積上形成高能量聲波，通過(guò)超聲波的熱效應(yīng)來(lái)破壞病變組織，從而發(fā)揮治療作用[11]。HIFU可以通過(guò)破壞病變組織內(nèi)部變性的毛細(xì)血管和神經(jīng)末梢來(lái)促進(jìn)正常組織細(xì)胞和毛細(xì)血管的生成，促進(jìn)皮膚組織的修復(fù)和再生，從而改善皮膚瘙癢和色素改變的臨床癥狀[12]。與單獨(dú)接受HIFU的患者比較，接受聯(lián)合治療的患者1個(gè)療程后臨床癥狀改善更加明顯，這是由于竹紅菌素不僅具有較強(qiáng)的抑菌作用，還可以刺激局部皮膚的新陳代謝，增加微循環(huán)，從而有效加快皮膚再生和組織修復(fù)[13]。竹紅菌素的光化學(xué)機(jī)制主要含有I、Ⅱ型光動(dòng)力學(xué)過(guò)程，兩種機(jī)制中光敏劑受光激發(fā)后產(chǎn)生活性氧（ROS），在有氧參與下，產(chǎn)生生物活性氧物質(zhì)，如單重態(tài)氧、超氧陰離子、羥基自由基和過(guò)氧化氫等?；钚匝跄苎趸?xì)胞中的生物大分子，如蛋白、脂肪酸及蛋白間的橋連結(jié)構(gòu)，破壞生物分子的結(jié)構(gòu)和功能，改變生物膜滲透性和流動(dòng)性，激活或抑制膜上的酶蛋白和受體，最終引起細(xì)胞的凋亡與壞死，從而起到殺菌抑菌的作用。

NNED雖然是一種發(fā)生在外陰的良性病變，但也有一定的惡變概率，目前認(rèn)為，NNED與細(xì)胞周期失調(diào)和微循環(huán)障礙有關(guān)。因此，筆者還對(duì)P16和CD34蛋白進(jìn)行研究。P16蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期的關(guān)鍵蛋白，在控制細(xì)胞增殖的過(guò)程中發(fā)揮十分重要的生理功能。研究認(rèn)為[14]，P16對(duì)維持細(xì)胞中抑癌基因Rb的活性狀態(tài)十分必要，通過(guò)與Cyclin依賴性激酶結(jié)合抑制原癌基因的活性，保證細(xì)胞增殖有序可控的進(jìn)行。鐘麗君等[15]的研究表明，在病變組織中P16蛋白的表達(dá)高于健康組織和病變旁組織，提示，P16蛋白在組織中的表達(dá)可能與NNED患者預(yù)后有關(guān)。在本研究中測(cè)量病變皮膚組織治療前P16蛋白水平可以發(fā)現(xiàn)，兩組患者經(jīng)過(guò)治療后P16蛋白水平均有所上升，提示再生的健康皮膚組織中P16蛋白含量也高于病變組織。CD34蛋白被認(rèn)為是一種具有較高特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，它在未成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)，通過(guò)對(duì)CD34蛋白的檢測(cè)，可以反映組織內(nèi)部新血管生成情況[16]。在病變的皮膚組織中，CD34蛋白表達(dá)增加，提示局部組織血管的過(guò)度增生可能與NNED發(fā)病相關(guān)。這也與之前的研究相符，楊靜等[17]的研究認(rèn)為在硬化性苔蘚型病變的組織當(dāng)中，CD34表達(dá)增加。經(jīng)過(guò)治療后的新生皮膚組織中，CD34蛋白表達(dá)趨于正常，也說(shuō)明血管增生在NNED發(fā)病中可能起到關(guān)鍵作用。觀察組患者治療后P16蛋白水平更高而CD34蛋白水平更低可能與觀察組患者病變出新生組織再生速度更快有關(guān)，竹紅菌素對(duì)局部皮膚組織再生起到促進(jìn)作用。

綜上所述，聚焦超聲聯(lián)合竹紅菌素軟膏治療NNED療效顯著，增加病變組織中P16蛋白含量，降低CD34蛋白含量，值得臨床推廣。