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    絲素蛋白的磷酸化及其仿生礦化膜的制備

    2018-11-28 05:18:18袁久剛
    紡織學(xué)報 2018年11期
    關(guān)鍵詞:絲素礦化磷酸

    周 倩, 袁久剛, 李 瀾, 王 平, 王 強

    (生態(tài)紡織教育部重點實驗室(江南大學(xué)), 江蘇 無錫 214122)

    絲素蛋白不僅可用作纖維原料,因其良好的生物相容性,在生物材料制備中也有潛在用途[1]。為拓寬絲素在生物材料及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用,不少研究者采用化學(xué)或生物的方法進行絲素改性加工,如采用辣根過氧化物酶(HRP酶)催化絲素接枝丙烯酸,加速礦化中絲素表面鈣鹽沉積,制備仿生礦化材料[2];采用磷酸進行絲素磷酸化,賦予絲素膜抗凝血性,用于制作止血材料等[3]。

    羥基磷灰石在自然界中主要由鈣磷灰石(Ca5(PO4)3(OH))自然礦物化形成,羥基磷灰石具有優(yōu)良的生物相容性和生物活性,可作為骨骼或牙齒的誘導(dǎo)因子被用于骨修復(fù)手術(shù)中。在生物材料表面生成羥基磷灰石的方法有很多種,按照礦化液的不同大致可分為3類:模擬體液法、交替礦化法和過飽和鈣化溶液法[4]。

    本文采用三聚磷酸鈉作為磷酸化試劑對絲素蛋白進行磷酸化,其機制是:絲素蛋白中絲氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)的羥基和賴氨酸(Lys)的氨基與無機磷發(fā)生酯化反應(yīng),形成C—O—P和C—N—P的結(jié)構(gòu)[5]。在磷酸化的絲素膜材料基礎(chǔ)上進行仿生礦化,誘導(dǎo)羥基磷灰石的形成,實現(xiàn)絲素基仿生礦化材料的制備。

    1 實驗部分

    1.1 實驗材料

    桑蠶絲練白綢(35.5 g/m2,江蘇鑫緣繭絲綢有限公司);三聚磷酸鈉(STP)、一水溴化鋰、無水氯化鈣、無水乙醇、十二水磷酸氫二鈉、對二苯酚、鉬酸銨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸等試劑(分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1絲素溶液的制備

    將桑蠶絲練白綢溶解在溴化鋰/無水乙醇/水(物質(zhì)的量比為1∶1∶2)體系中,在75 ℃條件下攪拌2 h得到絲素(SF)溶液,用去離子水對絲素溶液進行透析,直至透析液電導(dǎo)率值小于4 μS/cm,再將絲素溶液離心去除不溶物,以稱量法標(biāo)定上清液濃度,將絲素溶液在4 ℃條件下保存。

    1.2.2絲素的磷酸化

    分別取40 g/L的絲素蛋白溶液各30 mL, 用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值分別為8、9、10。在35 ℃作用下,緩慢加入0.24 g三聚磷酸鈉反應(yīng)30 min,反應(yīng)過程中用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值使其保持在加入STP前的固定值。反應(yīng)結(jié)束后冷卻,調(diào)節(jié)溶液pH值至中性。為探究STP的用量對絲素磷酸化的影響,同樣條件下控制pH值為10,溫度為35 ℃,分別加入質(zhì)量分別為0.06、0.24 g的STP(不同質(zhì)量的STP與SF反應(yīng)后的溶液分別標(biāo)記為SF-1, SF-2),反應(yīng)30 min。

    1.2.3絲素膜的制備

    風(fēng)干膜制備:將STP磷酸化后的絲素溶液中加入0.125 g甘油,混合均勻后將其轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯模具中,在恒溫恒濕箱中以流延法制備風(fēng)干膜。

    凍干膜制備:將STP質(zhì)量分別為0.06、0.24 g的磷酸化后的絲素溶液進行透析。透析完畢后將溶液在-50 ℃冷凍干燥成膜,將凍干膜在50%乙醇醇化處理4 h后再次凍干(不同質(zhì)量的STP與SF反應(yīng)后的膜分別標(biāo)記為SF-1膜,SF-2膜)。

    1.2.4絲素/羥基磷灰石復(fù)合材料的制備

    絲素/羥基磷灰石復(fù)合材料采用交替礦化法制備[6]。分別取未處理絲素凍干膜和磷酸化絲素凍干膜,用CaCl2/Tris-HCl溶液(CaCl2濃度為500 mmol/L;Tris-HCl濃度為50 mmol/L,pH值為7.45)進行鈣化,先在37 ℃下處理30 min,以去離子水水洗后,再將樣品浸漬在Na2HPO4/Tris-HCl (Na2HPO4濃度為300 mmol/L;Tris-HCl濃度為50 mmol/L,pH值為8.50)溶液中,在37 ℃下處理30 min,然后用去離子水水洗。上述過程被定為1個Ca-P礦化周期,重復(fù)7個周期直至結(jié)束。作為對比,磷酸化絲素膜只用CaCl2處理,不加Na2HPO4。不同礦化的處理條件如表1所示。

    表1 不同礦化處理條件Tab.1 Different mineralization conditions of silk membranes

    1.3 分析測試方法

    1.3.1磷含量的測定

    依據(jù)GB 12393—1990《食物中磷的測定方法》,采用磷鉬藍比色法[7]測定磷含量,原理為:無機磷元素在酸性溶液中會與鉬酸銨結(jié)合生成磷鉬酸銨,經(jīng)對苯二酚、亞硫酸鈉還原磷鉬酸銨后會形成藍色化合物鉬藍,其最大吸收波長是660 nm。

    磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別吸取1~5標(biāo)準(zhǔn)液(磷標(biāo)準(zhǔn)液用磷酸氫二鉀配制,質(zhì)量濃度為1 mg/mL)至50 mL刻度試管中,然后依次加入2 mL質(zhì)量分數(shù)為5%的鉬酸銨溶液、1 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的亞硫酸鈉溶液、1 mL質(zhì)量分數(shù)為0.5%的對苯二酚溶液,加水定容到20 mL,搖晃試管使溶液混合均勻,再靜置30 min。測定溶液660 nm處的吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=0.053 6x+0.089 5,R2=0.996 23。

    取反應(yīng)后溶液5 mL,加入15 mL三氯乙酸溶液(2 mol/L)沉淀絲素蛋白,靜置一段時間后離心,取上層清液2 mL及同樣的空白溶液,分別置于20 mL具塞試管中,其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線,磷轉(zhuǎn)移量以磷酸化后體系中磷質(zhì)量濃度的降低率表示。

    1.3.2圓二色譜和粒徑測試

    通過圓二色光譜儀檢測絲素溶液二級結(jié)構(gòu)的變化,取絲素樣品加入到1 mm 比色皿中,檢測波長范圍為195~250 nm,掃描速度為100 nm/min。使用粒徑及Zeta 電位分析儀測定25 ℃條件下絲素溶液的粒徑大小和粒徑分布。

    1.3.3化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

    采用Nicolet iS 10傅里葉紅外光譜儀(FT-IR)的全反射(ATR)模式,在掃描范圍為4 000~650 cm-1內(nèi)對不同的冷凍干燥膜樣品進行紅外光譜分析。掃描次數(shù)為32,分辨率為4 cm-1。

    1.3.4絲素膜對陽離子的吸附效果

    以陽離子染料進行絲素膜沾色實驗,沾色工藝條件:溫度為85 ℃,處理時間為30 min,浴比為1∶100,其中染料質(zhì)量濃度為0.2 g/L。吸附能力以沾色率表示,即膜材料沾色前后染液吸光度的變化率。

    1.3.5斷裂強度測試

    采用YG141型織物厚度儀測定絲素風(fēng)干膜厚度,采用萬能材料試驗機測定膜的力學(xué)性能,拉伸速度為40 mm/min,夾距為40 mm。測試前將樣品裁剪成尺寸為80 mm×5 mm的樣條,并在恒溫恒濕箱(溫度為20 ℃,相對濕度為65%)中平衡24 h,每個樣品進行10次重復(fù)實驗,樣品斷裂強度和斷裂伸長率分別由以下公式計算:

    式中:Q為斷裂強度,MPa;P為強力,N;d為厚度,mm;b為膜寬度,mm;ε為斷裂伸長率,%;L′為伸長,mm;L為原長,mm。

    1.3.6熱力學(xué)性能測試

    使用Q200型差示掃描量熱儀測定不同條件處理后的絲素凍干膜。測試條件:樣品質(zhì)量為5 mg,升溫速度為10 ℃/min,升溫范圍為100~400 ℃,氮氣流量為50.0 mL/min。

    1.3.7表面元素測試

    將樣品置于能量色散X射線能譜儀中分別進行線掃描和面掃描,測試出絲素膜表面元素含量和分布[8]。

    1.3.8形貌觀察

    使用SU1510型掃描電子顯微鏡觀察所制備的絲素材料的表觀形態(tài)結(jié)構(gòu),樣品經(jīng)過噴金處理,掃描加速電壓為5 kV。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 pH值和STP質(zhì)量對磷酸化程度影響

    磷轉(zhuǎn)移量一定程度上反映絲素蛋白的磷酸化效果,采用磷鉬藍比色法測得:當(dāng)pH值分別為8、9、10時,磷轉(zhuǎn)移量分別為35.5%、42.3%、67.1%。在pH值為8時磷轉(zhuǎn)移率最低,在pH值為10時磷轉(zhuǎn)移率最高。pH值較低時,磷酸根主要與賴氨酸反應(yīng),但絲素中賴氨酸含量很低,因此磷酸化程度就低。當(dāng)堿性增強時,Ser—OH電離成Ser—O-,此時親核取代效應(yīng)增強,游離的磷酸根基團與Ser—O-基團反應(yīng),氨基酸殘基側(cè)鏈中的羥基活性會變得越來越高[9],絲素蛋白磷酸化程度增加。

    圖1示出不同質(zhì)量的STP對磷酸化程度的影響。當(dāng)STP質(zhì)量較低時,隨著STP質(zhì)量的增加,磷酸化程度顯著增加;當(dāng)STP質(zhì)量達0.12 g時,磷酸化程度趨于穩(wěn)定。這表明磷酸根較少時,不是所有氨基酸殘基都能夠參加反應(yīng),有些可能因空間位阻和所處的化學(xué)環(huán)境限制了其反應(yīng)[10]。當(dāng)磷酸根足夠多時,氨基酸殘基能充分反應(yīng),磷酸化程度最大并趨于穩(wěn)定。

    圖1 不同質(zhì)量的STP對磷酸化程度的影響Fig.1 Effect of mass of STP on phosphorylation

    2.2 磷酸化對絲素蛋白結(jié)構(gòu)和粒徑的影響

    采用圓二色譜考察了絲素經(jīng)過磷酸化后二級結(jié)構(gòu)的變化,結(jié)果見圖2??煽闯?,絲素溶液在220 nm處有負峰,這說明絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主[11]。當(dāng)用STP處理后,220 nm 處負峰強度增大,表明絲素蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。通過計算得到絲素蛋白二級結(jié)構(gòu)的分布,見表2。

    由表2可知,SF的螺旋結(jié)構(gòu)最少,無序度最高。當(dāng)用STP處理SF后,其樣品的螺旋結(jié)構(gòu)都增加了,無規(guī)卷曲都有不同程度的減少,即磷酸化使得絲素的結(jié)構(gòu)更加完整,這也為后續(xù)的絲素膜材料構(gòu)建奠定了良好的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

    圖2 STP處理后絲素溶液的圓二色譜圖Fig.2 Circular dichroism of silk fibroin solution after STP treatment

    %

    由表2還可看出,當(dāng)STP質(zhì)量為0.06 g時,其螺旋結(jié)構(gòu)最多,無規(guī)卷曲最少,即適度的磷酸化對絲素蛋白結(jié)構(gòu)影響較大。

    為進一步驗證磷酸化對絲素溶液粒徑產(chǎn)生的影響,測定了反應(yīng)前后絲素溶液的粒徑分布變化,結(jié)果如圖3所示。可以看出,3組樣品的主要粒徑分布范圍在100~250 nm之間,其中SF的平均粒徑和多分散性指數(shù)(PDI)分別為143.5 nm和0.528。當(dāng)用STP處理SF 溶液后,粒徑分布都有不同程度的增大。STP質(zhì)量為0.06 g時,平均粒徑和PDI分別為158.5 nm和0.566;而當(dāng)STP質(zhì)量為0.24 g時,絲素溶液的平均粒徑增大到171.5 nm,PDI為0.615。這是因為磷酸根的引入使得絲素溶液間的靜電斥力增加,使得粒徑分布增加。

    圖3 STP處理后絲素溶液的粒徑分布Fig.3 Size distribution of fibroin solution after STP treatment

    2.3 磷酸化絲素化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

    為進一步證明絲素中氨基酸與STP發(fā)生反應(yīng)的結(jié)構(gòu)變化,利用紅外光譜儀的全反射模式對不同處理條件的絲素膜進行測試,其結(jié)果如圖4所示。可以看出,絲素蛋白的特征酰胺鍵主要分布在1 654、1 513 cm-1附近,表明經(jīng)過冷凍干燥后的再生絲素蛋白材料以無定形結(jié)構(gòu)為主[12]。STP中磷酸根的特征峰在896 cm-1處,絲素經(jīng)過STP處理后,在921 cm-1處有新峰,其位置對應(yīng)是P—O鍵的伸縮振動峰[13],即證明絲素成功被STP磷酸化。

    圖4 磷酸化的絲素凍干膜ATR-FT-IR光譜圖Fig.4 ATR-FT-IR spectra of phosphorylated silk fibroin

    2.4 磷酸化絲素膜對陽離子的吸附效果

    磷酸化影響絲素蛋白表面電荷分布,使得絲素蛋白分子表面負電性基團增多。借助陽離子染料沾色實驗,探究磷酸化絲素表面對陽離子的吸附。結(jié)果發(fā)現(xiàn),STP質(zhì)量為0、0.06、0.24 g時對應(yīng)的沾色率分別為9.3%、16.2%、31.8%。磷酸化會在蛋白質(zhì)分子中引入負電性磷酸根基團,陽離子染料帶正電,與絲素間結(jié)合力主要為庫侖引力。根據(jù)絲素膜表面沾色率變化,可判別出絲素膜磷酸化的程度。當(dāng)STP質(zhì)量為0.24 g時,絲素對染料的沾色率增至31.8%,表明絲素磷酸化有利于膜表面陽離子的吸附,為后續(xù)絲素表面鈣磷酸鹽的吸附和沉積奠定了基礎(chǔ)。

    2.5 磷酸化對絲素?zé)崃W(xué)和力學(xué)性能影響

    為深入分析磷酸化對絲素膜材料熱力學(xué)性能的影響,采用差示掃描量熱儀分析絲素膜的熱力學(xué)轉(zhuǎn)變溫度,結(jié)果如圖5所示。可以看出,SF蛋白膜存在3個明顯的吸熱峰,其中在50、121 ℃附近的吸熱峰分別是由于自由水和結(jié)合水的蒸發(fā)引起的,在278 ℃附近的吸熱峰則是由于絲素蛋白膜材料熱降解引起的,該溫度為絲素蛋白的熱分解溫度[14]。經(jīng)過STP處理后的SF膜,絲素蛋白的熱性能發(fā)生了較小的變化,但從圖5可看出,當(dāng)溫度升高到285 ℃左右以后,經(jīng)過磷酸化的SF膜完全被降解,可見STP的引入使得SF膜的熱穩(wěn)定性有所下降。原因是:磷酸根的引入使得絲素蛋白質(zhì)分子間的氫鍵被大量破壞,引入大量負電基團使靜電斥力加大,從而導(dǎo)致樣品的熱性能急劇降低。

    圖5 磷酸化絲素膜的DSC曲線Fig.5 DSC curves of phosphorylated silk fibroin membranes

    為探究絲素磷酸化對風(fēng)干膜材料力學(xué)性能的影響,測定了絲素風(fēng)干膜的斷裂強度和斷裂伸長率,結(jié)果如圖6所示??梢钥闯觯寒?dāng)STP質(zhì)量為0.06 g時,對應(yīng)的樣品斷裂強度和斷裂伸長率最高;當(dāng)STP質(zhì)量為0.24 g,所對應(yīng)的樣品斷裂強度、斷裂伸長率最低。當(dāng)STP質(zhì)量為0.24 g時,樣品斷裂強度下降,這是因為在磷酸化過程中,蛋白分子中羥基或氨基磷酸化后,不僅使分子間氫鍵減少,且引入的負電磷酸根基團加大了蛋白分子間的靜電斥力。當(dāng)STP質(zhì)量為0.06 g時,樣品斷裂強度比原樣稍有提高。從絲素二級結(jié)構(gòu)可看出,絲素蛋白經(jīng)0.06 g STP處理后,無序度最低,且螺旋結(jié)構(gòu)變多,使得力學(xué)性能增加,即抵消了磷酸化對膜材料強力的消極影響。

    圖6 磷酸化絲素膜的力學(xué)性能Fig.6 Mechanical properties of phosphorylated silk fibroin membranes

    2.6 仿生礦化膜表面元素和形貌分析

    采用能量色散X射線能譜儀分析經(jīng)過仿生礦化絲素膜表面不同元素的含量,其結(jié)果如表3所示。當(dāng)SF經(jīng)STP處理后,引入了部分磷酸根,因此將磷酸化后的絲素膜只用CaCl2處理時,其中Ca元素和P元素含量隨著磷酸化程度的提高而增加,其中P元素的引入都是STP磷酸化導(dǎo)致的,也因此間接反映磷酸化程度。當(dāng)用CaCl2/Na2HPO4對磷酸化的絲素膜進行仿生礦化后,Ca元素和P元素含量都相比只用CaCl2礦化的絲素膜高。

    表3 仿生礦化后的絲素膜表面元素含量Tab.3 Element contents of silk fibroin membrane surfaces after bionic mineralizction %

    為更直觀地觀測絲素膜礦化后的變化,借助掃描電鏡對各個絲素膜的形貌變化進行觀察,結(jié)果如圖7所示。

    圖7 不同礦化條件下絲素膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)(×300)Fig.7 Morphological structures of silk membranes under different mineralization conditions(×300)

    從圖7可看出,未經(jīng)磷酸化處理的SF膜表面很光滑,經(jīng)過CaCl2/Na2HPO4交替礦化處理的SF膜表面變得很粗糙,有少量顆粒狀無機物生成,表明有磷酸鈣鹽或羥基磷灰石晶體生成,但其分布并不均勻。隨著磷酸化程度增加,SF/STP處理膜表面生成的羥基磷灰石晶體逐漸增多,且分布較均勻。礦化過程中用CaCl2/Na2HPO4處理的絲素膜表面生成的羥基磷灰石數(shù)目比僅用CaCl2處理的絲素膜要多,即絲素經(jīng)STP磷酸化后,提供了部分的磷酸根,從而為礦化過程提供了更多的沉積位點。

    3 結(jié) 論

    1)絲素蛋白在三聚磷酸鈉質(zhì)量為0.24 g、pH值為10、35 ℃條件下處理30 min,獲得了較好的磷酸化效果;絲素經(jīng)過磷酸化處理后,蛋白二級結(jié)構(gòu)和分子粒徑發(fā)生變化,磷酸化絲素膜對陽離子的吸附能力較空白樣增加。

    2)采用三聚磷酸鈉作為磷酸化試劑對絲素蛋白的力學(xué)與熱穩(wěn)定性有影響,當(dāng)磷酸化程度較高時,絲素膜材料的力學(xué)與熱力學(xué)性能發(fā)生不同程度的下降。

    3)磷酸化絲素膜經(jīng)CaCl2/Na2HPO4交替礦化處理后,其表面較空白樣生成更多羥基磷灰石,采用三聚磷酸鈉作為磷酸化試劑有利于絲素基仿生礦化材料的制備。

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