程序性死亡因子配體1(PD-L1)在乳腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系和預(yù)后分析

邱志敏 王美鑑 付愛榮 王雅琦 董涵之 傅穎媛

乳腺癌是1個(gè)重要的全球衛(wèi)生問題，在女性惡性腫瘤中高居首位。目前隨著腫瘤綜合治療的深入開展，乳腺癌的診療越來越規(guī)范，患者生存期逐漸延長，盡管乳腺癌治療已經(jīng)獲得非常成功，但是隨著隨訪時(shí)間的延長發(fā)現(xiàn)10年內(nèi)仍有50%的乳腺癌出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。針對激素受體陽性型乳腺癌可以給予內(nèi)分泌藥物維持治療，針對HER-2過表達(dá)型可以給予靶向治療，但是針對三陰性乳腺癌后續(xù)卻缺乏更多有效的治療手段，導(dǎo)致此類患者死亡率較高。因此迫切的需要在三陰性乳腺癌患者中尋找更多的可以有效預(yù)測療效的生物標(biāo)志物以及更多的治療方法。有研究表明在三陰性乳腺癌患者腫瘤組織及腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞中可見程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)的高表達(dá)[1]。程序性死亡配體-1(PD-L1)是PD-1的配體之一，是免疫檢查點(diǎn)的一部分，對預(yù)防自身免疫至關(guān)重要[2]。PD-1/PD-L1信號通路的激活可以導(dǎo)致腫瘤逃脫T淋巴細(xì)胞的免疫監(jiān)視從而出現(xiàn)免疫逃逸，而通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路可以使腫瘤細(xì)胞重新被T淋巴細(xì)胞免疫監(jiān)視，從而達(dá)到殺滅腫瘤細(xì)胞的作用。本研究旨在系統(tǒng)比較三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌及癌旁組織的PD-L1表達(dá)以及與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，同時(shí)探討PD-L1的表達(dá)與不同分子分型乳腺癌的生存關(guān)系及預(yù)后分析，為乳腺癌患者特別是三陰性乳腺癌患者的免疫檢查點(diǎn)治療提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

組織切片為經(jīng)術(shù)后病理確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌組織110例及同期術(shù)后癌旁組織30例。收集其完整的病理資料及臨床資料。年齡為30～86歲，中位年齡48歲。N0期51例，N1期31例，N2期10例，N3期18例。M0期99例，M1期11例。行改良根治術(shù)99例，行保乳手術(shù)11例。Ⅰ期21例，Ⅱ期56例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例。ER陰性71例，陽性39例。PR陰性74例，陽性36例。三陰性乳腺癌50例，HER-2過表達(dá)型、LuminalB型、LuminalA型各20例。

1.2 材料與試劑

來自Abcam公司的兔抗人PD-L1單克隆抗體(克隆號28-8)，來自Dako公司的DAB染色劑及Dako EnVision TM檢測系統(tǒng)，PBS緩沖液、EDTA修復(fù)液、蘇木精染液、檸檬酸緩沖液均來自廣州安必平公司。

1.3 免疫組化方法

將蠟塊進(jìn)行常規(guī)切片，二甲苯、酒精脫蠟，水化及高壓鍋抗原修復(fù)，滴加相應(yīng)抗體，陰性對照片上滴加PBS緩沖液，滴加已配好的DAB顯色液顯色，蘇木精染液復(fù)染，封片，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠進(jìn)行封片，最后在顯微鏡下進(jìn)行閱片。根據(jù)陽性細(xì)胞占所在組織所有細(xì)胞的比例及陽性細(xì)胞染色深淺來進(jìn)行計(jì)分判斷。按顯色細(xì)胞數(shù)占百分比：顯色的陽性細(xì)胞所占百分比<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；按陽性細(xì)胞顯色深淺計(jì)分：無陽性細(xì)胞顯色為0分，1+即淺黃色為1分，2+即棕色為2分，3+即深褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比分?jǐn)?shù)及陽性細(xì)胞顯色深淺分?jǐn)?shù)相乘。>1為陽性，≤1則為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，PD-L1表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析，累計(jì)生存率的比較采用Kaplarn-Meei檢驗(yàn)，單因素分析比較采用Logistic回歸分析，多元回歸分析采用多因素COX回歸模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有的檢測都是雙側(cè)的，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)結(jié)果

三陰性乳腺癌PD-L1陽性表達(dá)36%，HER-2過表達(dá)型乳腺癌PD-L1陽性表達(dá)25%，luminalB型乳腺癌PD-L1陽性表達(dá)20%，luminalA型乳腺癌及癌旁組織PD-L1陽性表達(dá)0(圖1)。免疫組化染色結(jié)果顯示:27例乳腺癌患者PD-L1陽性表達(dá)，鏡下可見深淺不同的著色(深褐色至淺黃色)；PD-L1陰性鏡下則未見明顯著色。

圖1 PD-L1在乳腺癌癌組織及癌旁組織中的表達(dá)結(jié)果

2.2 PD-L1表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

單因素分析提示：PD-L1表達(dá)與陽性淋巴結(jié)、TNM分期呈正相關(guān)，與ER、PR受體呈負(fù)相關(guān)。行改良根治術(shù)的患者PD-L1表達(dá)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于行保乳手術(shù)的乳腺癌患者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PD-L1表達(dá)在三陰性乳腺癌中較非三陰性乳腺癌中高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。多因素分析提示：PD-L1表達(dá)與陽性淋巴結(jié)個(gè)數(shù)及TNM分期相關(guān)(表2)。

2.3 各臨床病理特征與臨床預(yù)后關(guān)系相關(guān)性分析

單因素分析提示：總生存期與陽性淋巴結(jié)個(gè)數(shù)、腫瘤大小、TNM分期、PD-L1表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)，與ER、PR狀態(tài)呈正相關(guān)；總生存期與分子分型相關(guān)，其中三陰性乳腺癌及l(fā)uminal B型乳腺癌中PD-L1表達(dá)陽性與預(yù)后差相關(guān)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。多因素分析提示：PD-L1表達(dá)是影響乳腺癌臨床預(yù)后的唯一預(yù)測因素(表4)。

2.4 PD-L1表達(dá)與乳腺癌患者總生存期的關(guān)系

多因素分析提示：乳腺癌患者中PD-L1表達(dá)是影響患者臨床預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表1 PD-L1在乳腺癌中的表達(dá)與其臨床病理特征的相關(guān)性單因素分析/例

表2 PD-L1表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性多因素分析

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在世界各地迥然不同。我國乳腺癌發(fā)病率在北京、上海等發(fā)達(dá)城市高發(fā)[3]。對于激素受體陰性及HER-2陰性的患者給予手術(shù)及放化療之后缺乏有效的維持治療手段，而且三陰性乳腺癌發(fā)病年齡較輕、侵襲性高、分化差、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移多、預(yù)后極差，目前臨床上缺乏有效的特異性治療手段。但是考慮這種類型的乳腺癌被證明是免疫原性腫瘤，所以系統(tǒng)免疫療法利用患者自身的免疫系統(tǒng)直接消滅和靶向腫瘤細(xì)胞已作為三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)有效的治療手段[4]。

PD-1/PD-L1信號通路是目前免疫靶向治療的熱點(diǎn)話題，被越來越多的研究者所關(guān)注，它是一對協(xié)同刺激分子，其在T淋巴細(xì)胞的激活過程中起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。目前PD-L1在許多惡性腫瘤中均有表達(dá)，如非小細(xì)胞肺癌、尿路上皮癌、軟組織肉瘤、乳腺癌、惡性黑色素瘤、腸癌等大部分實(shí)體瘤中均有表達(dá)。在已經(jīng)報(bào)道不同的研究中PD-L1在惡性腫瘤中的表達(dá)差異較大(1.7%～58%)[5-8]。本研究乳腺癌PD-L1陽性表達(dá)率為24.5%，在三陰性乳腺癌PD-L1陽性表達(dá)率高達(dá)36%。

Sang等[6]發(fā)現(xiàn)乳腺癌中PD-L1表達(dá)與高組織學(xué)分級、陰性淋巴結(jié)、病理分期早、高腫瘤浸潤細(xì)胞數(shù)目、激素受體陰性表達(dá)、HER-2陽性表達(dá)、表皮生長因子受體、P53及高增殖表達(dá)呈正相關(guān)。QIN等[7]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中PD-L1高表達(dá)與大負(fù)荷腫瘤、較高的組織分級、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)及激素受體表達(dá)陰性呈正相關(guān)。Muenst等[8]發(fā)現(xiàn)乳腺癌PD-L1表達(dá)與年齡、腫瘤大小、原發(fā)腫瘤的分類、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、激素狀態(tài)及腫瘤增殖情況等相關(guān)。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)高PD-L1表達(dá)和增加的FOXP3+Treg浸潤均與高組織學(xué)級別、陰性ER有關(guān)，還有PR狀態(tài)和侵略性的腫瘤亞型，尤其是基底樣的亞型相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達(dá)與陽性淋巴結(jié)、TNM分期呈正相關(guān)，與雌激素受體、孕激素受體呈負(fù)相關(guān)；與分子分型相關(guān)，特別是三陰性乳腺癌表達(dá)高于非三陰性乳腺癌；與手術(shù)方式相關(guān)，改良根治術(shù)患者PD-L1表達(dá)明顯高于保乳手術(shù)患者。

表3 影響乳腺癌總生存率的臨床病理特征單因素分析

表4 影響乳腺癌總生存率的多因素分析

Sang等[6]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1是乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測因子。Muenst等[8]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)與總生存期呈負(fù)相關(guān)，是總生存期獨(dú)立不良預(yù)后因素。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1和FOXP3+Treg的高表達(dá)與更差的預(yù)后相關(guān)，這兩個(gè)標(biāo)記物都是降低患者總體生存的獨(dú)立預(yù)測因子。Baptista等[10]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中PD-L1的表達(dá)與乳腺癌患者的總體生存率有顯著的相關(guān)性。Pan等[11]研究中發(fā)現(xiàn)間質(zhì)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中PD-L1高表達(dá)能顯著提高總生存期和無進(jìn)展生存。本研究發(fā)現(xiàn)對總生存期有影響的陽性淋巴結(jié)個(gè)數(shù)、腫瘤大小、TNM分期、ER、PR、分子分型、PD-L1表達(dá)等因素納入COX多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)是影響乳腺癌臨床預(yù)后的唯一預(yù)測預(yù)后因子；亞組分析提示在三陰性乳腺癌及l(fā)uminal B型乳腺癌中PD-L1表達(dá)陽性與不良的總生存相關(guān)。

PD-1/PD-L1信號通路的激活可以使腫瘤細(xì)胞逃脫T淋巴細(xì)胞的監(jiān)視而導(dǎo)致免疫逃逸，從而使腫瘤細(xì)胞活躍終使機(jī)體患有腫瘤或者使腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，而通過阻斷該通路可以使T淋巴細(xì)胞重新監(jiān)視腫瘤細(xì)胞繼而殺滅腫瘤細(xì)胞。PD-L1高表達(dá)患者能更好地進(jìn)行有效的免疫治療，本研究證實(shí)了在乳腺癌中特別是三陰性乳腺癌PD-L1高表達(dá)，這為乳腺癌特別是三陰性乳腺癌的免疫治療研究，提供1個(gè)有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。