靶向EGFR抗體融合UL16結(jié)合蛋白2激活NK細(xì)胞治療結(jié)直腸癌的體內(nèi)外研究

文家治

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC) 是全球常見的惡性腫瘤，大約有20 %的結(jié)直腸癌發(fā)展為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，其患者5年內(nèi)生存率僅僅不到10 %。結(jié)直腸癌傳統(tǒng)的治療方法為手術(shù)、化學(xué)治療和放射治療，但都存在著靶向性低、細(xì)胞毒性大等缺點(diǎn)[1-2]。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是臨床上研究比較多的一個(gè)腫瘤治療靶點(diǎn)，EGFR和其相應(yīng)的配體結(jié)合后，結(jié)合為同源二聚體,也可以與其他TK受體結(jié)合從而激活細(xì)胞內(nèi)TK區(qū),通過啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終抑制腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，并且能夠耐受放療和化療等治療,所以，EGFR在腫瘤發(fā)生以及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，EGFR在胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤中高表達(dá),在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要角色，其通過阻斷EGFR 信號(hào)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[3-4]。NK 細(xì)胞表面活化性受體(natural killer cell activating receptor,NKG2D)是一種NK 細(xì)胞、CD8 + T 細(xì)胞、NKT 細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的蛋白。而UL16 結(jié)合蛋白(unique long 16-binding proteins,ULBP)是NKG2D 的一種配體,據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)表明 ULBP蛋白參與了機(jī)體對(duì)肺癌、胃癌及宮頸癌的免疫過程，NK細(xì)胞可通過識(shí)別結(jié)直腸癌細(xì)胞表面ULBP3，通過NKG2D介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)來清除腫瘤細(xì)胞[5-6]。本研究主要探究靶向EGFR抗體融合UL16結(jié)合蛋白2激活NK細(xì)胞治療結(jié)直腸癌的體內(nèi)外活性。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基以及胎牛血清FBS購于賽默飛世爾公司(美國)；PBS和雙抗(青霉素和鏈霉素)購于普洛立德生物科技有限公司；蛋白Marker 購于金斯瑞生物科技有限公司;FITC-標(biāo)記的羊抗人IgG抗體購于南京賽博生物公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相關(guān)耗材購于賽業(yè)生物科技有限公司；CytoTox96 非放射性細(xì)胞毒性試劑盒購于普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 目標(biāo)融合蛋白的表達(dá)以及純化 在GeneBank中搜索靶向EGFR的抗體-西妥昔單抗的基因和UL16結(jié)合蛋白2的基因，合成后利用G4S柔性肽把兩者進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后使用畢赤酵母X-33表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。將上一步得到的發(fā)酵液通過硫酸銨沉淀法進(jìn)行提取，然后再采用Protein A以及層析柱法進(jìn)一步將蛋白分離純化，然后通過Western blot對(duì)得到的蛋白進(jìn)行鑒定，從而獲得產(chǎn)量高以及純度高的目標(biāo)融合蛋白。

1.2.2 通過流式細(xì)胞儀測(cè)定目標(biāo)融合蛋白與HCT116細(xì)胞的結(jié)合 將HCT116細(xì)胞充分分散在培養(yǎng)基中，每組分散成106的單細(xì)胞懸液。將上述細(xì)胞細(xì)胞懸液分為西妥昔單抗組、目標(biāo)融合蛋白組以及空白脫脂牛奶對(duì)照組。在西妥昔單抗組細(xì)胞中加入250 μL濃度為200 μg/mL西妥昔單抗抗體，在目標(biāo)融合蛋白組細(xì)胞中加入250 μL濃度為200 μg/mL目標(biāo)融合蛋白，在空白對(duì)照組細(xì)胞中加入250 μL脫脂牛奶，3組在冰上進(jìn)行孵育1 h，然后用PBS進(jìn)行洗滌，用FITC-標(biāo)記的羊抗人IgG抗體進(jìn)行孵育，用PBS進(jìn)行洗滌，將3組分別上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。使用Foxtable2017對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

1.2.3 MTT法 取對(duì)數(shù)期HCT116細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×104個(gè)/mL。96孔板用PBS液封，每孔取100 μL細(xì)胞懸液種板，37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)。12 h后待細(xì)胞貼壁后，給藥。每孔加入配制好的西妥昔單抗或目標(biāo)融合蛋白液體50 μL，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，空白背景組和空白對(duì)照組補(bǔ)加50 μL DEPC水，37 ℃、5 % CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后，每孔加25 μL MTT工作液，左右前后搖晃均勻，37 ℃孵育4 h。4 h后4 000 rpm 離心10 min。小心吸出每孔培養(yǎng)基。每孔加入DMSO 150 μL，用微型振蕩器震蕩(500 r，10 min)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度(OD)值，選取檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm，測(cè)定其OD值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 ADCC法測(cè)定目標(biāo)融合蛋白激活NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力 選用NK92細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，靶細(xì)胞是HCT116細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置了NK92細(xì)胞與HCT116細(xì)胞不同比值的各個(gè)實(shí)驗(yàn)組，比值分別為1∶1、1∶50、100∶1，5種對(duì)照組(靶細(xì)胞自發(fā)LDH釋放、效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)LDH釋放、靶細(xì)胞最大LDH釋放、培養(yǎng)基背景對(duì)照以及裂解液體積校正對(duì)照組)，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。按照試劑盒步驟將各種檢測(cè)試劑混合加入到細(xì)胞毒檢測(cè)板中，然后放在37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育4 h;孵育結(jié)束后，用移液槍移取10 μL細(xì)胞裂解液加入到靶細(xì)胞最大釋放孔內(nèi)，裂解45 min后，收集上清液;孵育4 h之后，用離心機(jī)250 g進(jìn)行離心4 min;然后用移液槍吸取50 μL每孔中的上清液加入到一塊新的96 孔板中相對(duì)應(yīng)的孔；然后在每孔中加入對(duì)應(yīng)的底物中，然后在室溫下進(jìn)行避光孵育30 min。然后在每孔加入50 μL終止液進(jìn)行終止;在1 h內(nèi)必須進(jìn)行檢測(cè)，在492 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光值。細(xì)胞毒性=(實(shí)驗(yàn)組吸收值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放吸收值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放吸收值) /(靶細(xì)胞最大釋放吸收值-靶細(xì)胞自發(fā)釋放吸收值)×100。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 高純度目標(biāo)融合蛋白的獲得

西妥昔單抗和ULBP分別合成之后，然后通過PCR技術(shù)將西妥昔單和ULBP連接重組后，將Cetuximab-ULBP導(dǎo)入質(zhì)粒中，通過畢赤酵母X-33進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)過純化后，并且利用Western blot驗(yàn)證后確定我們得到了高純度且構(gòu)象正確的融合蛋白(靶向EGFR抗體融合UL16結(jié)合蛋白2)。

2.2 流式細(xì)胞儀測(cè)定目標(biāo)融合蛋白和HCT116細(xì)胞的結(jié)合能力

靶向EGFR受體的西妥昔單抗和靶向EGFR抗體融合UL16結(jié)合蛋白2可與HCT116細(xì)胞表面相結(jié)合。流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果表明：西妥昔單抗和HCT1167細(xì)胞的結(jié)合率為79.21%，而靶向EGFR抗體融合UL16結(jié)合蛋白2和HCT1167細(xì)胞的結(jié)合率為73.53%，這表明了本研究制備的目標(biāo)抗體仍然保持了母體抗體結(jié)合HCT116細(xì)胞的活性。

2.3 MTT結(jié)果

本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定目標(biāo)融合蛋白對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116的增殖抑制活性。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，和對(duì)照組相比較，西妥昔單抗組和目標(biāo)融合蛋白組對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并且呈濃度依賴性。西妥昔單抗組抑制HCT116細(xì)胞增殖率為73.76%，目標(biāo)融合蛋白組抑制HCT116細(xì)胞增殖率為71.98%，兩者活性相當(dāng)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了我們制備的目標(biāo)融合蛋白仍保留了西妥昔單抗抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性。另外，本實(shí)驗(yàn)還通過MTT法測(cè)定了不同濃度下西妥昔單抗和目標(biāo)融合蛋白的抗腫瘤活性，從表1可以看出兩者的抗腫瘤活性相當(dāng)，并且抗腫瘤活性呈濃度依賴性。

表1 MTT法測(cè)定西妥昔單抗組和目標(biāo)融合蛋白組對(duì)HCT116細(xì)胞的抑制率/%

2.4 ADCC實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)制備的目標(biāo)融合蛋白同時(shí)具備人IgGl抗體上完整的Fc片段和可以激活NK細(xì)胞的NKG2D片段，目標(biāo)融合蛋白能夠通過以上2種途徑增強(qiáng)NK細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞殺傷結(jié)直腸癌細(xì)胞，增強(qiáng)目標(biāo)融合蛋白(Cetuximab-ULBP)的ADCC作用。選用NK92細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)目標(biāo)融合蛋白(Cetuximab-ULBP)對(duì)這種殺傷作用的增強(qiáng)效果。結(jié)果顯示(表2)，Cetuximab-ULBP能顯著增強(qiáng)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞的殺傷作用。選用NK92細(xì)胞作為為效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)Cetuximab和ULBP效靶比為100∶1時(shí)，西妥昔單抗和Cetuximab-ULBP都能夠增強(qiáng)NK92的殺傷HCT116腫瘤細(xì)胞的作用，其中Cetuximab-ULBP組的細(xì)胞裂解率為(45.34±7.14)%，而西妥昔單抗組的細(xì)胞裂解率是(38.24±6.11)%，兩者比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。原因主要是目標(biāo)融合蛋白可以與結(jié)腸癌細(xì)胞結(jié)合，從而將NKG2D分子固定結(jié)合在結(jié)腸癌細(xì)胞的表面，從而誘導(dǎo)NK92和靶細(xì)胞之間發(fā)生相互作用，最終激活NK92細(xì)胞起到殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的作用。

表2 ADCC實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞裂解率

注：*為與對(duì)照組相比,P<0.05;#為與西妥昔單抗組相比,P<0.05。

3 討論

近年來EGFR是臨床上腫瘤治療的新靶點(diǎn)，臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGFR在結(jié)直腸癌等多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)，并且在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生以及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究表明，通過抑制EGFR的表達(dá)，能夠起到抗腫瘤的作用，在腫瘤治療中具有良好的研究前景[7-8]。ULBP是一種可以激活NK細(xì)胞的配基,ULBP蛋白參與了機(jī)體對(duì)肺癌、胃癌及宮頸癌的免疫過程，NK細(xì)胞可通過識(shí)別結(jié)直腸癌細(xì)胞表面ULBP3，可以通過NKG2D介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)來清除腫瘤細(xì)胞，從而使腫瘤細(xì)胞脫離免疫逃逸[9-10]。本實(shí)驗(yàn)將具有靶向性的抗體和ULBP分子相結(jié)合，具有靶向性的抗體能夠靶向到結(jié)直腸癌胞表面的特異性受體，起到抗腫瘤作用，并且還可以通過NKG2D介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)來清除腫瘤細(xì)胞，重塑機(jī)體NK細(xì)胞的殺傷作用，從而實(shí)現(xiàn)靶向雙重抗腫瘤的作用。

本研究成功地構(gòu)建并且表達(dá)目標(biāo)融合蛋白靶向EGFR抗體融合UL16結(jié)合蛋白2，并且成功克隆目標(biāo)融合蛋Cetuximab-ULBP；通過Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了目標(biāo)融合蛋白的正確表達(dá)以及成功裝配。通過體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們的融合蛋白并沒有喪失抗體西妥昔單抗對(duì)HCT116腫瘤細(xì)胞原有的抗腫瘤活性，通過流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明我們的融合蛋白并沒有喪失抗體西妥昔單抗對(duì)HCT116腫瘤細(xì)胞原有的結(jié)合能力。ADCC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和單一親本抗體進(jìn)行相比較，本研究構(gòu)建的目標(biāo)融合蛋白Cetuximab-ULBP介導(dǎo)NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的作用更強(qiáng)，從而起到抗腫瘤細(xì)胞的作用，這是由于我們的目標(biāo)融合蛋白能夠成功地將ULBP靶向到結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞表面，存在NK細(xì)胞表面的活化型受體NKG2D成功被ULBP激活，從而發(fā)揮了NK細(xì)胞介導(dǎo)地對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的免疫殺傷作用。Cetuximab-ULBP還可以通過Fc段及MICB段的介導(dǎo)，存在協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。

綜上所述，與單一西妥昔單抗相比，靶向EGFR抗體融合UL16結(jié)合蛋白2通過介導(dǎo)免疫細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞而增強(qiáng)其抗腫瘤活性，在臨床上可作為一種結(jié)直腸癌治療的新方法。