苦豆子總生物堿對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠中HSP70的影響*

李 華，駱文婷，陳澤偉，鄭慰武，謝文源，龍亞秋，鄧虹珠△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510515；2.廣東省中醫(yī)院急診科，廣州 510120)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)為慢性非特異性自身免疫性疾病，是一種發(fā)生于結(jié)腸部位的慢性潰瘍性病變，與遺傳、免疫、感染、環(huán)境等多種因素有關(guān)，以腹瀉、黏液、膿血便、腹痛和里急后重等為主要癥狀。流行病學(xué)表明，我國UC年患病率為11.6/10萬[1]。近年來隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣的改變，環(huán)境的變化，該病在我國的發(fā)病率有逐年增高。由于UC病程長，病變范圍廣，患者生活質(zhì)量嚴(yán)重受限，且有5%～10%的UC患者易發(fā)生癌變，臨床上至今尚無特異性根治措施，被WHO列為現(xiàn)代難治病之一。因該病西藥治療不良反應(yīng)多或價(jià)格昂貴，患者不易堅(jiān)持長期用藥，且復(fù)發(fā)率較高，而中醫(yī)療法不良反應(yīng)較小，具有簡捷、長效、價(jià)廉、安全的特點(diǎn)，顯示出獨(dú)特優(yōu)勢，具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。

據(jù)筆者前期研究，苦豆子總生物堿(TASA)能改善三硝基苯磺酸(TNBS)致UC的動物模型的結(jié)腸炎性反應(yīng)[3-6]。本研究采用TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠，隨機(jī)分組、造模處理，從熱休克蛋白70(HSP70)探討TASA對TNBS誘導(dǎo)的UC的影響。

1 材料與方法

1.1材料 選取SPF 級 SD 大鼠55只，雄性，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部動物所。將大鼠分為 5 組,每組11只：即空白對照組(A組)、模型組(B組)、柳氮磺吡啶(SASP)組(C組)、TASA高劑量組(D組)，TASA低劑量組(E組)，B組、C組、D組、E組采用TNBS復(fù)制UC大鼠模型。

1.2主要試劑 TNBS(批號2016715)購自南方醫(yī)科大學(xué)試劑中心，0.80 mL TNBS+0.25 mL 50%乙醇備用造模。SASP(批號151201)購自廣東省中醫(yī)院；TASA(含槐定堿25.17%)由廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供；聯(lián)苯胺(批號060201)購自中國遠(yuǎn)航試劑廠；過氧化氫(批號151217)購自廣東恒健制藥有限公司；冰醋酸(批號20160423)購自南方醫(yī)科大學(xué)試劑中心。

1.3方法

1.3.1模型復(fù)制及處理 采用TNBS/乙醇法造模。造模前大鼠禁食24 h(不禁水)，經(jīng)10水合氯醛腹腔麻醉后，將TNBS/乙醇液(TNBS 100 mg/kg+50% 乙醇0．25 mL)用橡膠輸液管由大鼠肛門輕緩注入深約8 cm腸腔內(nèi)留置，次日即出現(xiàn)癥狀，大鼠懶動、厭食，出現(xiàn)血便和體質(zhì)量減輕等，與臨床癥狀極為相似，空白對照組注入等量生理鹽水。造模同時(shí)：C組灌胃給予SASP(400 mg/kg)，D組灌胃給予TASA(60 mg/kg)，E組灌胃給予TASA (15 mg/kg)。

1.3.2觀察指標(biāo) 每天在給予處理前觀察大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤、活動狀態(tài)等變化并記錄體質(zhì)量變化、大便性狀和便血情況(鄰聯(lián)苯胺法FOB試紙檢測)。對后3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行DAI評分。DAI= (體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3。HSP70檢測：處死動物，腹主動脈采血，1 500 r/min離心5 min留血清，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測血清HSP70水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大便隱血評分比較 實(shí)驗(yàn)中期隱血評分：與A組比較，B組、C組、D組、E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)后期隱血評分：與B組比較，A組、C組、D組、E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2各組DAI評分比較 實(shí)驗(yàn)中期DAI評分：與A組比較，B組、D組、E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，A組、C組、D組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。后期DAI評分：與B組比較，A組、C組、D組、E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3各組HSP70水平比較 與A組比較，B組、C組、D組、E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與B比較，A組、C組、D組、E組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表1 大鼠大便隱血評分比較分)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05

表2 大鼠DAI評分比較分)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05

表3 5組大鼠HSP70水平比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05

3 討 論

苦豆子別名苦豆根、苦甘草、布亞(維吾爾語)等，是豆科槐屬植物苦豆子的干燥全草、根及種子，生長于中亞、西亞一帶和我國西北省區(qū)荒漠區(qū)內(nèi)較潮濕的地段。在我國主要分布于新疆、內(nèi)蒙古、陜西、山西、寧夏、甘肅、西藏等地區(qū)?？喽棺邮驾d于我國最早的藥學(xué)文獻(xiàn)《神農(nóng)本草經(jīng)》，現(xiàn)收載于《中國藥典》《全國中草藥匯編》《新疆中草藥》《維吾爾藥志》等。全株味苦性寒，具有清熱解毒、祛風(fēng)燥濕、止痛殺蟲等作用?？喽棺又饕煞譃樯飰A，有槐果堿、苦參堿、氧化苦 參堿、槐定堿、槐胺堿等；民間常用于菌痢、腸炎。

據(jù)筆者前期研究，TASA能顯著改善TNBS和葡聚糖硫酸鈉(DSS)致UC的動物模型的一般體征，抑制患鼠體質(zhì)量下降，減輕結(jié)腸病理學(xué)改變，能夠使免疫抑制患鼠體質(zhì)量增加，胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)增加；初步作用機(jī)制研究說明主要通過抗炎和免疫調(diào)節(jié)等多種途徑抑制結(jié)腸炎性反應(yīng)[3-6]。TASA是苦豆子治療UC的主要活性部位，已取得國家專利“TASA在制備治療UC藥物中的應(yīng)用及結(jié)腸靶向制劑的制備方法”(ZL200410052029.0)，擁有自主知識產(chǎn)權(quán)。

HSP是一組在結(jié)構(gòu)上高度保守的多肽，每種應(yīng)激均可誘導(dǎo)產(chǎn)生HSP，因此HSP又稱為應(yīng)激蛋白[7-8]。HSP的功能:(1)HSP是高度保守的蛋白質(zhì)，參與廣泛的生物過程。HSP70作為分子伴侶在許多細(xì)胞過程發(fā)揮作用，包括蛋白生物活性的調(diào)節(jié)、分泌蛋白的跨膜轉(zhuǎn)位等[9]。(2)提高細(xì)胞抗應(yīng)激能力。(3)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。(4)HSP的抗氧化作用。(5)HSP的免疫學(xué)作用：包括參與抗原加工遞呈；參與抗感染免疫(HSP能夠明顯減弱炎癥過程中蛋白的滲出，抑制炎性反應(yīng))；參與自身免疫等。

本研究結(jié)果表明，模型組HSP70下降，治療組HSP70升高，提示TASA可能通過提高保護(hù)性蛋白水平，維持促炎因子與抗炎因子處于平衡狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)腸道局部免疫應(yīng)答和緩解炎癥程度。本研究進(jìn)一步豐富了TASA治療UC的作用機(jī)制。

HSP作為生物體在非正常刺激下所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其研究已成當(dāng)今生命科學(xué)的熱點(diǎn)。HSP的功能十分廣泛，在疾病中的意義重大?？傊琀SP以不同的形式在免疫中有免疫效果，其在疾病中的應(yīng)用前景廣闊。因?yàn)樯趹?yīng)對環(huán)境變化的過程中，機(jī)體產(chǎn)生HSP來適應(yīng)生存，所以開展對HSP的研究是有意義的[8]。