豬膀胱細胞外基質對人臍帶Wharton膠間充質干細胞生物相容性實驗

王 冰，黃靖香，盧世璧，彭 江

1首都醫(yī)科大學密云教學醫(yī)院，北京 101500；2解放軍總醫(yī)院 骨科研究所/北京市再生醫(yī)學重點實驗室/全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷重點實驗室，北京 100853

許多疾病可使膀胱喪失功能，如癌癥、創(chuàng)傷、先天性疾病等，臨床常采取腸代膀胱等手術治療方法，但存在感染、梗阻、黏液分泌、電解質紊亂、穿孔等問題。早在1994年，Cilento等完成了體外泌尿系移行上皮細胞的大規(guī)模擴增，至此揭開了組織工程膀胱研究的序幕[1]。隨著組織工程技術的進步，出現了組織工程尿道[2]、膀胱[3]等在泌尿外科領域的臨床應用。組織工程技術包含支架材料、種子細胞和生長因子。天然膀胱細胞外基質(bladder accellular matrix，BAM)是較好的支架材料，含有的膠原和彈性纖維等利于細胞黏附生長。本實驗研究采用化學脫細胞法制備的豬膀胱細胞外基質作為支架材料，復合人臍帶WJ-MSCs，探索二者之間的相容性，為組織工程膀胱的研究探索新的種子細胞。

材料和方法

1 實驗動物及材料 選取巴馬香豬6只，購自解放軍醫(yī)學院醫(yī)學動物中心，體質量15 kg左右，雄性。本研究經解放軍總醫(yī)院動物倫理委員會審批。DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；PBS緩沖液(Hyclone公司，美國)；0.05%胰酶(Gibco，US)；胎牛血清(Gibco，美國)；Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國)；青/鏈霉素(雙抗)混合液(Gibco，美國)；MTT試劑(美國Sigma公司)；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(北京方潤生物公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(美國Sigma公司)。

2 豬膀胱細胞外基質(PBAM)的制備及鑒定 取實驗用香豬的新鮮膀胱6枚置于無菌瓶中(圖1A)，去除周圍脂肪、筋膜等組織。對照組：無菌PBS反復洗滌后取1 cm×1 cm膀胱組織做冷凍切片，并行HE、甲苯胺藍和Hoechst33258染色。實驗組：將預儲存-20℃冰箱內的膀胱置于氧化還原酸化水中，漂洗3次，隨后置于-20℃低滲凍存。然后將其浸泡于3%過氧化氫溶液中，置搖床，直至變白。加入1% SDS溶液(pH=9)，置搖床，定時換液。重新置入6% Triton X-100(pH=9)，置搖床至膀胱呈白色(圖1B)。取脫細胞后的膀胱組織(1 cm×1 cm)做冰凍切片，設為實驗組，同法行三種染色后觀察。將PBAM行冷凍干燥機凍干后置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

3 透鏡及掃描電鏡觀察PBAM 以掃描電鏡(Hitachi S-4800)觀察PBAM結構，以無水乙醇法測孔隙率，每塊PBAM測試3次，然后取平均值。

4 人臍帶WJ-MSCs的分離、培養(yǎng)及成脂、成骨誘導 人臍帶由解放軍總醫(yī)院產科提供，已征得產婦及家屬書面同意。實驗完全符合國務院頒布的《醫(yī)療機構管理條例》相關規(guī)定[4]。將臍帶以75%乙醇消毒(圖2A)，0.9%氯化鈉注射液洗滌后剪成3段，完整剔除臍帶內2根動脈和1根靜脈(圖2B)。將Wharton膠撕下置入培養(yǎng)皿中反復洗滌，再移入錐形瓶后離心6 min(1 700 r/min)，離心后棄去洗滌液。Wharton膠中加入DMEM培養(yǎng)液，將Wharton膠剪成1 ～ 4 mm3微小組織勻漿塊。加入DMEM培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)皿，置入細胞培養(yǎng)箱。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，以1∶2比例傳代。取P3代人臍帶WJ-MSCs分別按照成脂、成骨相應方法進行誘導分化。誘導完成后采用油紅O、茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察。

5 細胞增殖實驗 按國家生物材料評價標準制備PBAM浸提液，實驗組將包含10% FBS的25%、50%和100%濃度的PBAM浸提液培養(yǎng)細胞，對照組以DMEM培養(yǎng)細胞。將密度為1.5×105/ml的人臍帶WJ-MSCs接種于96孔板上，分別與25%、50%和100%濃度的浸提液和對照組DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。將第1天的孔內加入MTT溶液培養(yǎng)4 h，加入DMSO溶液，酶聯免疫檢測儀于570 nm條件下測定吸光度(A)值。第2 ～ 6天同樣處理并測定，最后記錄并繪制增殖曲線。另外，取將1×106/ml密度的人臍帶WJ-MSCs懸液接種于6孔板內的PBAM表面，共9孔為實驗組；以相同細胞密度懸液單純接種于6孔板內，共9孔為對照組，全部置入培養(yǎng)箱中，第3、5、7天取材，每次每組各取3個孔，以酶消化法收集細胞計數后進行比較。

6 細胞-支架復合物的相容性觀察 PBAM的6孔板接種1×106/ml密度的細胞懸液，培養(yǎng)后分別于第5、7、9天取材，冷凍切片后行Hoechst33258及AO染色，于熒光顯微鏡下觀察。同時將第5天的細胞-支架復合物以10%戊二醛固定，行掃描電鏡(SEM)觀察WJ-MSCs在PBAM上的生長情況。

7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。全部數據以-x±s表示，組間比較采用重復測量方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 PBAM制備 A:新鮮豬膀胱外觀; B:脫細胞膀胱; C:凍干的PBAMFig. 1 PBAM preparation A: appearance of fresh porcine bladder; B: acellular bladder; C: lyophilized PBAM

圖2 人臍帶Wharton膠A：人臍帶外觀，B：Wharton膠, 2根動脈和1根靜脈Fig. 2 Human umbilical cord Wharton glue A: appearance of human umbilical cord; B: Wharton glue, two arteries and one vein

圖3 兩組分別進行3種染色，對照組見明顯細胞核排列，而實驗組則未見細胞殘留Fig. 3 The two groups were stained with three kinds of dyeing. The nucleus of the control group was obviously arranged, but there was no cell residue in the experimental group

結 果

1 PBAM的觀察及鑒定 HE染色：實驗組可見大量淡粉色的膠原纖維，未見被藍染的細胞核，對照組可見大片排列整齊被藍染的細胞核。甲苯胺藍染色：實驗組未見被藍染的細胞核，可顯示膀胱組織富含堿性黏多糖，對照組可見大片被藍染的細胞核。Hoechst33258染色：實驗組未見被藍染的細胞核殘留，對照組可見排列整齊、分布均勻且被藍染的細胞核(圖3)。

2 透鏡及掃描電鏡觀察(SEM)PBAM 光鏡下可見PBAM為多孔材料，孔隙致密，孔隙間交互貫通(圖4A)。SEM掃描可見PBAM外層表面大小不一的孔隙，內側面可見較多褶皺，粗糙不平(圖4B)。經無水乙醇法檢測PBAM的孔隙率約為93%。

3 人臍帶WJ-MSCs形態(tài)觀察 Wharton膠組織塊培養(yǎng)4 d后可見干細胞爬出較多，第6天可見大量呈魚群狀細胞排列生長，高倍鏡下觀察細胞形態(tài)略呈三角狀或成纖維狀，細胞體積大且細胞核不規(guī)則，核仁明顯，排列緊密(圖5)。

圖4 PBAM形態(tài)A：透鏡下的PBAM，可見較多孔隙，以及相互貫通； B：SEM下呈大小不同的多個孔隙(×1 000)Fig. 4 PBAM under the perspective electron microscopy and SEM A: pores and interpenetration can be seen； B: multiple pores with different sizes (×1 000)

圖5 WJ-MSCs形態(tài) A：培養(yǎng)4 d后干細胞從組織塊內爬出(×100)； B：WJ-MSCs呈多邊形或三角形(×100)； C：培養(yǎng)6 d后呈魚群樣生長(×100)Fig. 5 WJ-MSCs morphology A: at 4 days after culture, stem cells crawled out of the tissue block (x 100); B: WJ-MSCs showed polygon or triangle shape (×100); C: fibroblast-like growth (×100) at 6 days after culture

圖6 人臍帶WJ-MSCs成脂、成骨誘導A：成脂誘導油紅“O”染色，可見大量的脂滴形成(×100)； B：成骨誘導茜素紅染色，可見許多鈣化點，以及高倍鏡下的黑色鈣結節(jié)(×100)Fig. 6 WJ-MSCs adipogenic and osteogenic induction A: oil red staining for adipogenic induction (×100); B: alizarin red staining for osteogenic induction(×100)

圖7 不同濃度PBAM浸提液對人臍帶WJMSCs增殖的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of PBAM extracts on the proliferation of human umbilical cord WJ-MSCs

4 人臍帶WJ-MSCs的成脂、成骨分化誘導結果及鑒定 P3代人臍帶WJ-MSCs成脂誘導后行油紅O染色，鏡下見WJ-MSCs堆積形成脂滴(圖6A)；而成骨誘導液培養(yǎng)后行茜素紅染色，鏡下見許多散在鈣化點，高倍鏡下可見黑色鈣結節(jié)(圖6B)。

5 細胞增殖實驗 不同濃度浸提液組與DMEM組的吸光度(A)值進行比較，結果顯示不同濃度浸提液與DMEM對人臍帶WJ-MSCs的增殖無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(圖7)。將1×106/ml密度的人臍帶WJ-MSCs培養(yǎng)至第3、5、7天，以酶消化法收集3個時間段的細胞進行計數，結果顯示兩組細胞的增殖高峰均在培養(yǎng)的第5天，實驗組的細胞增加率高于對照組(P＜0.05)(見表1)。

6 細胞-支架復合物活性觀察 復合物培養(yǎng)至第5天后，行Hoechst33258染色見PBAM上有大量黏附生長的WJ-MSCs，且細胞核呈藍染(圖8A)，AO染色提示PBAM上可見大量活細胞(圖8B)。掃描電鏡觀察第5天的細胞-支架復合物，在PBAM的表面可見大量迭連排列的WJ-MSCs，孔隙間也有大量WJ-MSCs黏附、生長，分布于PBAM表面，細胞周邊發(fā)出偽足樣突起黏附PBAM上 (圖 8C，圖 8D)。

表1 實驗組與對照組細胞計數Tab. 1 Cell count in experimental group and control group(×105)

討 論

近些年，隨著組織工程皮膚的產業(yè)化，以及組織工程膀胱和尿道的臨床應用，人臍帶WJMSCs在疾病的治療和損傷組織修復中發(fā)揮了巨大作用[5]。張玉石等[6]采用化學去細胞法制備了PBAM，按不同比例部分修補了犬膀胱缺損，結果證實化學法制備的PBAM具有較好的生物安全性。本研究制備的PBAM經化學脫細胞處理后，行3種染色提示脫細胞效果滿意，且該方法保留利于種子細胞黏附生長的成分。Farhat等[7]對PBAM進行了研究顯示其存留有Ⅰ、Ⅲ型纖維膠原蛋白，而且彈性蛋白、層黏連蛋白和纖連蛋白僅略有減少，其余肌動蛋白、肌凝蛋白和波形蛋白等仍存在，PBAM仍維持其機械特性。本研究通過掃描電鏡可見外層表面大小不一的孔隙，內側面可見較多褶皺，粗糙不平，測定其孔隙率為93%，適合種子細胞的黏附生長。

間充質干細胞的擴增和分化是隨著細胞生長環(huán)境的外部信號和微環(huán)境的改變而變化的。本研究從人臍帶Wharton膠中分離培養(yǎng)出的間充質干細胞，通過形態(tài)學觀察和生物學特性的鑒定，成功誘導其進行多向分化，如成骨、脂肪細胞等，與研究報道結果一致[8-10]。田洪榛等[11]研究發(fā)現18個月內經冠狀動脈移植WJ-MSCs可改善缺血性心衰患者左心室功能，24個月時仍提高了患者活動耐量及生活質量，且安全有效。Yuan等[12]收集第1 ～ 5代膀胱平滑肌細胞培養(yǎng)液上清，配制成條件培養(yǎng)液成功誘導WJ-MSCs定向分化為膀胱平滑肌細胞。人臍帶WJ-MSCs來源于醫(yī)療廢棄的人臍帶，易獲得，常規(guī)培養(yǎng)即可，且具有間充質干細胞的生物特性，是較好的干細胞治療及種子細胞的選擇，也被用來進行臨床疾病的治療[13]。

圖8 細胞-支架復合物 A：培養(yǎng)第5天后行Hoechst33258染色(×100)，可見大量被藍染的細胞核，且排列整齊； B：AO染色(×100)，PBAM表面有大量活細胞，呈亮紅色； C：培養(yǎng)第5天的SEM結果(×1 000)，可見PBAM表面黏附有大量人臍帶WJ-MSCs； D為局部放大2 000倍，可見伸出多個類似偽足樣突起黏附于PBAM表面Fig. 8 Cell-Scaffold complex A: at the 5 days after culture, Hoechst33258 staining (×100) showed a large number of blue stained nuclei and they arranged orderly; B:AO staining (×100)showed a large number of living cells on the surface of PBAM with bright red color, C: at the 5 days after culture (×1 000), a large number of human umbilical WJ-MSCs adhered to PBAM surface, D for local amplification of 2 000 times, showed a number of pseudo foot like projections were sticking to the surface of PBAM.

Chen等[14]將豬內皮祖細胞與BAMG復合，同時外源性給予血管生成因子(VEGF)后發(fā)現，VEGF可以提高結合內皮祖細胞的BAMG的新血管形成，可作為增加組織工程膀胱血供的適宜途徑。而且Hsieh等[15]研究發(fā)現人臍帶WJ-MSCs比骨髓MSC更具血管再生能力，以及對神經的保護作用。高紅亮和易發(fā)現[16]研究發(fā)現利用大鼠膀胱無細胞基質負載大鼠骨髓間充質干細胞在體外成功構建組織工程膀胱復合物。王瓊等[17]膀胱脫細胞基質-絲素蛋白雙層支架經皮下預制處理后，修復大鼠膀胱擴大術后膀胱缺損的效果滿意。本實驗采用人臍帶WJ-MSCs作為種子細胞復合PBAM支架材料，PBAM浸提液對細胞增殖的影響與對照組DMEM培養(yǎng)液無明顯差異(P＞0.05)，說明化學法制備的PBAM無細胞毒性，且可促細胞增殖。目前由于PBAM的制備還無統(tǒng)一標準，而其生物安全性的相關檢測還需進一步完善。Li等[18]證實人臍帶WJ-MSCs能夠表達前列腺特異性抗原，表明其在泌尿系統(tǒng)中的應用潛能。本實驗觀察到人臍帶WJ-MSCs進入PBAM孔隙內，且很快變形為多邊形，伸出類似偽足黏附于PBAM上，自身分泌的細胞外基質也促進其黏附、增殖及分化，成功制備了細胞-支架復合物補片。該實驗為后期體內試驗提供研究基礎，也為組織工程膀胱的研究提供了新的種子細胞。