碳青霉烯酶在亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌中的作用

侯盼飛，祝麗晶，潘 艷

(漣水縣人民醫(yī)院 檢驗科，江蘇 漣水223400)

鮑曼不動桿菌為革蘭氏陰性桿菌，廣泛定植于人體皮膚、口腔、呼吸道、胃腸道及泌尿生殖道等部位，可引起醫(yī)院內(nèi)獲得性肺炎、腦膜炎、敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染及傷口感染等。從2005年到2014年其檢出率、耐藥率急劇上升[1]，尤其對碳青霉烯類耐藥已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本研究對亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌(Imipenem resistant Acinetobacter baumannii，IRAB)的耐藥性及碳青霉烯酶的攜帶情況作一探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 臨床菌株：選取2016年1月12月我院臨床分離的非重復(fù)鮑曼不動桿菌100株，其中IRAB和亞胺培南敏感鮑曼不動桿菌(Imipenem sensitive Acinetobacter baumannii，ISAB)各50株。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922購自江蘇省臨檢中心。

1.1.2試劑 抗菌藥物粉劑購自上海科佳藥檢器材公司，血瓊脂培養(yǎng)基購自安圖生物工程股份有限公司，PCR反應(yīng)試劑盒購自上海生工生物科技有限公司。

1.1.3儀器 Vitek2 compact細(xì)菌鑒定儀購自法國生物梅里埃公司，PCR擴增儀購自美國ABI公司，凝膠成像儀、電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗 采用瓊脂稀釋法檢測100株鮑曼不動桿菌對臨床常用16種抗菌藥物的耐藥性。具體方法及結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)參照CLSI 2014年版[2]。

1.2.2改良Hodge試驗 將大腸埃希菌ATCC25922菌懸液均勻涂布于M-H瓊脂平板上，干燥后，在平板上中心貼10μg亞胺培南紙片，用1 μl接種環(huán)挑取3-5個待測菌株并在平板上接種，接種時從平板中心紙片邊緣向平板邊緣劃線，長度至少20-25 mm,35℃培養(yǎng)過夜，觀察生長狀況。

1.2.3PCR擴增 采用煮沸法提取基因組DNA。引物序列如表1所示，由上海英濰捷基公司合成。PCR反應(yīng)采用25 μl體系，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性30 s，54-60℃(具體退火溫度見表1) 45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀下觀察特異性擴增條帶。

表1 碳青霉烯酶基因引物序列及退火溫度

1.2.4序列測定 選取部分?jǐn)U增產(chǎn)物送上海英濰捷基公司進行測序。結(jié)果用基因庫中的Blast程序進行同源性分析。

1.2.5統(tǒng)計分析 采用SAS8.0統(tǒng)計學(xué)軟件對資料進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1藥敏結(jié)果所檢測100株細(xì)菌對替加環(huán)素、多粘菌素B均敏感，IRAB除對頭孢哌酮/舒巴坦(32%)和米諾環(huán)素(30%)耐藥率低外，對其他抗菌藥物耐藥率均較高，而ISAB除對氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑林、頭孢西丁耐藥外，對多數(shù)抗生素均較敏感。IRAB和ISAB耐藥性比較見表2。

2.2改良Hodge試驗結(jié)果50株IRAB中有41株出現(xiàn)矢狀生長現(xiàn)象，即產(chǎn)碳青霉烯酶，陽性率82%，50株ISAB均為陰性。

2.3基因檢測結(jié)果PCR擴增顯示IRAB中SHV、PER、TEM、OXA-23陽性率分別為70%、56%、34%和90%，與ISAB相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。將 PCR 擴增產(chǎn)物純化后進行測序，結(jié)果經(jīng)Blast 比對，SHV、PER、TEM和OXA-23與 Genbank相關(guān)基因同源性分別為99%、98%、97%和100%。所檢測菌株KPC、NDM、IMP、VIM、SIM和OX-24基因均陰性。

表2 亞胺培南耐藥與敏感鮑曼不動桿菌耐藥性比較

IRAB:imipenem resistant Acinetobacter Baumannii;ISAB:imipenem sensitive Acinetobacter Baumannii.

表3 亞胺培南耐藥與敏感鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果

IRAB:imipenem resistant Acinetobacter Baumannii;ISAB:imipenem sensitive Acinetobacter Baumannii

3 討論

鮑曼不動桿菌是引起醫(yī)院感染的重要條件致病菌，高檢出率、高耐藥率引起國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。2012年由國內(nèi)知名專家發(fā)起和起草的《中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識》，將鮑曼不動桿菌列為我國目前最重要的“超級細(xì)菌”[3]。2017年世界衛(wèi)生組織公布全球抗菌藥物耐藥菌優(yōu)先性列表將耐碳青霉烯類的鮑曼不動桿菌列為優(yōu)先1級(危急)。鮑曼不動桿菌一旦對碳青霉烯類耐藥往往會呈現(xiàn)多重耐藥甚至泛耐藥。

2016年Chinet細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)[4]對國內(nèi)主要地區(qū)30所教學(xué)醫(yī)院病原菌耐藥性監(jiān)測顯示，不動桿菌屬(鮑曼不動桿菌占90.6%)對多數(shù)藥物耐藥率均在50%以上，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別高達68.6%和71.4%。本研究顯示IRAB除對多粘菌素B、替加環(huán)素均敏感，對頭孢哌酮/舒巴坦(32%)、米諾環(huán)素(30%)耐藥率較低外，對其它藥物耐藥率均超過70%，與Chinet及其它學(xué)者的報道基本一致[4-6]。IRAB治療非常棘手，一種方法是選擇更高級的抗生素，如替加環(huán)素、多粘菌素，另一種方法是聯(lián)合用藥，如選用頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦或碳青霉烯類聯(lián)合氨基糖苷類或喹諾酮類藥物[3,7]。

產(chǎn)碳青霉烯酶是鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥的重要原因[8]。CLSI[2]要求腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶初篩試驗陽性和對一種或多種三代頭孢菌素(包括頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑肟和頭孢曲松)耐藥，應(yīng)使用改良Hodge試驗進行碳青霉烯酶確證試驗。但國內(nèi)外對改良Hodge試驗檢測鮑曼不動桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶研究較少，Lee等[9]對28株不動桿菌進行檢測發(fā)現(xiàn)改良Hodge試驗是檢測碳青霉烯酶非常有效的方法。本研究顯示，IRAB中碳青霉烯酶表型陽性率82%，而ISAB全陰性，說明產(chǎn)碳青霉烯酶是鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥的重要原因。

常見的碳青霉烯酶主要包括[10]：A 類超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，如SHV、TEM、KPC、RER、CTX等，可引起青霉素類、碳青霉烯類等耐藥，可被克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦抑制；B 類酶，又稱為金屬β-內(nèi)酰胺酶，對β-內(nèi)酰胺類抗生素具有強大的水解能力，包括IMP、VIM、SIM、NDM；D類苯唑西林酶(OXA)，主要包括OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58等亞型，其中OXA-23是鮑曼不動桿菌中報道最多的。本研究對鮑曼不動桿菌10種常見碳青霉烯酶基因檢測發(fā)現(xiàn)SHV、PER、TEM、OXA-23陽性率分別為70%、56%、34%和90%，與ISAB相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；未檢出KPC、NDM、IMP、VIM、SIM和OX-24，與明德松等[11]的報道基本一致。

鮑曼不動桿菌耐藥機制復(fù)雜多樣，有報道TEM常聯(lián)合孔道蛋白缺失或AdeABC外排泵存在引起碳青霉烯類耐藥[12]，OXA-23介導(dǎo)的耐藥常與插入序列ISAbal等[13]相關(guān)。本研究也顯示ISAB中OXA-23陽性率雖與IRAB存在顯著差異，但高達42%，顯著高于潘紅超(2.9%)等[14]的報道，因此推測可能還存在其他耐藥機制，不同耐藥機制間存在相互作用關(guān)系，這有待進一步研究。