人臍帶間充質(zhì)干細胞上清液對大鼠肝星狀細胞生長的影響

汪文穎,郝利銘，尹 菲，黃可欣，姜文華

(吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 組胚教研室，吉林 長春130021)

隨著國內(nèi)外對干細胞研究的深入和技術(shù)的發(fā)展，間充質(zhì)干細胞(mensenchymal stem cells,MSCs)因其來源豐富,取材方便、容易,免疫原性低,具有多向分化的潛能成為治療肝纖維化的研究熱點[1,2]。肝纖維化是慢性肝損傷的終末期，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)激活后分泌大量膠原蛋白，造成細胞外基質(zhì)的過度沉積而導致的肝損傷在肝纖維化的發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。據(jù)相關(guān)研究[3,4]MSCs上清液含有干細胞分泌的相關(guān)因子[5]，可以作為MSCs移植[6-8]的替代療法。本文利用臍帶來源的MSCs研究其上清液對大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

見表1。

表1 實驗細胞、試劑的來源

1.2 方法

1.2.1人臍帶間充質(zhì)干細胞( human umbilical cord mensenchymal stem cells,hUCMSCs)的純化、擴增、凍存和復蘇

臍帶來源于吉林大學白求恩第一醫(yī)院健康足月分娩的新生兒。本研究通過吉林大學倫理委員會審批，家屬均簽署知情同意書。按文獻報道的方法[9]采用組織塊貼壁法獲得hUCMSCs，采用10%FBS+DMEM+雙抗培養(yǎng)液在37℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，0.25% 胰酶消化傳代培養(yǎng)以純化。凍存：消化細胞制備單細胞懸液， 1 000 rpm×3 min中 離心,棄上清，置于10%DMSO+20%FBS+DMEM 的凍存液中,直接放入順序降溫盒中，隔天放入液氮罐凍存。復蘇：從液氮罐中取出凍存管，迅速移入37℃水浴鍋輕輕搖動使其融化，移入離心管中添加適量PBS混勻,1 000 rpm×3min 離心，棄上清，添加5 ml培養(yǎng)液混勻，置于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。并鑒定凍存、復蘇對hUCMSCs的形態(tài)的影響。

1.2.2hUCMSCs上清液的提取

取第3、4 代hUCMSCs,計數(shù)2.4×105cell/5ml培養(yǎng)液/瓶,常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后，收集液體，0.22 μm濾膜過濾后，2 000 rpm×5 min 低溫離心，收集上清，-80℃保存。

1.2.3HSC-T6 細胞培養(yǎng)、傳代、凍存及復蘇

HSC-T6細胞培養(yǎng)在10%FBS+1%雙抗+89%DMEM-H的培養(yǎng)液中，于37℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。待細胞達到80%融合時，取對數(shù)生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。 凍存和復蘇方法同1.2.1。

1.2.4實驗分組

實驗取對數(shù)生長期HSC-T6細胞接種于培養(yǎng)板中，24 h后分為3 組，分別為對照組(10%FBS+1%雙抗+89%DMEM-H)、25%hUCMSCs 上清液組(10%FBS+1%雙抗+25%hUCMSCs上清液+64%DMEM-H)、50%hUCMSCs 上清液組(10%FBS+1%雙抗+50%hUCMSCs上清液+39%DMEM-H)。

1.2.5hUCMSCs上清液對HSC-T6細胞形態(tài)的影響

將HSC-T6按2×104細胞/1 ml/孔，接種于24孔板中，按1.2.4中的實驗分組，分別于培養(yǎng)0 h、24 h、48 h后，顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)和形態(tài)變化。

1.2.6MTT檢測hUCMSCs上清液對HSC-T6細胞增殖的影響

HSC-T6以4×104細胞/ml，每孔100 μl接種于96 孔板中。按2.4中的分組，設置4 個板，每組設6 復孔，分別用于檢測細胞貼壁后培養(yǎng)12 h,24 h,36 h,48 h 的細胞增殖情況。 在達到培養(yǎng)時間前4 h進行MTT 檢測。每孔加入5 g/L 的MTT 溶液20 μl，作用4 h后棄上清。每孔加入DMSO 溶液150 μl，溶解形成的甲臜結(jié)晶。作用10-20 min后，在分光光度計490 nm 波長下檢測吸光值。以A490 下的吸光度值代表細胞的相對數(shù)量，反映細胞增殖情況。

1.2.7Annexin V-FITC/PI 雙染檢測hUCMSCs上清液對HSC-T6凋亡的影響

將HSC-T6按2×104細胞/1 ml/孔，接種于24孔板中，按1.2.4中的實驗分組，培養(yǎng)48 h。

(1)各組細胞用不含EDTA 的胰酶消化后，300 g，4℃離心5 min 收集細胞。

(2)用預冷的PBS 洗滌細胞2 次，每次均需300 g，4℃離心5 min。收集1-5×105細胞。

(3)加入100 μl 1×Binding Buffer 重懸細胞。

(4)加入5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI Staining Solution，輕輕混勻。

(5)避光、室溫反應10 min。

(6)加入400 μl 1×Binding Buffer，混勻。

(7)滴1滴用Annexin V-FITC/PI 雙染的細胞懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC 熒光信號呈綠色，PI 熒光信號呈紅色。

1.2.8免疫細胞化學檢測hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞TGF-β1、α-SMA 表達的影響

HSC-T6以2×105細胞/ml/每孔接種于帶有細胞載玻片的24孔板中，按1.2.4中分組情況，培養(yǎng)48 h后，取出載玻片，采用免疫組化SP染色方法，按說明書要求操作,進行TGF-β1、α-SMA抗體染色，TGF-β1的一抗稀釋為1∶600、α-SMA的一抗稀釋為1∶800，DAB顯色。染色完成后顯微鏡下觀察并分析TGF-β1、α-SMA的陽性表達情況。

1.2.9統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0 軟件計算每組數(shù)據(jù)的均值和方差，所得結(jié)果均采用平均值±標準差(means±SD)表示，采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，當P<0.05時表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 組織塊貼壁法培養(yǎng)hUCMSCs 細胞的形態(tài)

組織塊貼壁后1周可見散在、貼壁生長的細胞集落。原代細胞培養(yǎng)需10-14 d,傳代后在3-5 d細胞需再次傳代,細胞低密度時長成扁平單層細胞,細胞生長密度增加趨于融合時,細胞形態(tài)變得細長,形態(tài)類似成纖維細胞,呈平行排列生長或旋渦狀生長，凍存復蘇后細胞形態(tài)和生長狀況穩(wěn)定(圖1)。按照課題組已發(fā)表的論文鑒定為MSCs[10,11]。

2.2 hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞形態(tài)的影響

對照組HSC-T6細胞貼壁生長、呈星形或多邊形伸展狀態(tài)，胞內(nèi)含大量顆粒；隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量明顯增加。(見圖2 A1、 A2、A3)；25%hUCMSCs上清液組HSC-T6細胞，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞突起減少，細胞數(shù)目減少(見圖2 B1、B2、B3)；50%hUCMSCs上清液組在24 h、48 h與0 h對比發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)更加不規(guī)則，細胞體積減小、突起減少明顯，細胞數(shù)量明顯減少 (見圖2 C1、C2、C3)。

2.3 hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞增殖的影響

MTT結(jié)果分析顯示(表1)，12 h時3組細胞數(shù)量無明顯差異(P>0.05)。培養(yǎng)24 h后，25% hUCMSCs上清液組、50% hUCMSCs上清液組HSC-T6 細胞的增殖受到抑制，與對照組相比，均差異顯著(P<0.05)；培養(yǎng)36 h后,25% hUCMSCs上清液組、50% hUCMSCs上清液組與對照組相比，HSC-T6 細胞的增殖明顯受到抑制，差異顯著(P<0.05)；培養(yǎng)48 h后，25%hUCMSCs上清液組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，50%hUCMSCs上清液組和對照組相比差異性極其顯著(P<0.001)，25%hUCMSCs上清液組和50%hUCMSCs上清液組相比差異性極其顯著(P<0.001)。

A：傳代培養(yǎng)24 h的 hUCMSCs B:傳代培養(yǎng)48 h的hUCMSCsC：傳代培養(yǎng)72 h 的hUCMSCs D:復蘇后培養(yǎng)96 h的hUCMSCs

A1、A2、A3分別為對照組0 h、24 h、48 h；B1、B2、B3分別為25% hUCMSCs上清液組0 h、24 h、48 h；C1、C2、C3分別為50% hUCMSCs上清液組0 h、24 h、48 h

圖2 hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞形態(tài)的影響

*:與對照組比較P<0.05;**:與對照組比較P<0.01;***:與對照組比較P<0.001；#：與25% hUCMSCs上清液組比較P<0.05；△：與25% hUCMSCs上清液組比較P<0.001。

2.4 hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI 雙染顯示綠色、紅色熒光的細胞分別為早期、晚期凋亡細胞。對照組HSC-T6 細胞綠色熒光、紅色熒光的細胞較少(圖3 A、B、C)。 25%hUCMSCs上清液組、50%hUCMSCs上清液組凋亡的細胞數(shù)量均增多(圖3D、E、F、 G、H、I)，凋亡細胞百分率與對照組相比，均明顯增加(圖3J)，差異顯著(P<0.01)。

A、B、C 為對照組；D、E、F為25% hUCMSCs上清液組；G、H、I為50% hUCMSCs上清液組 J為3組凋亡細胞百分率對比圖**：與對照組相比P<0.01

圖3AnnexinV-FITC/PI雙染檢測hUCMSCs上清液對HSC-T6細胞凋亡的影響

2.5 hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞中TGF-β1、α-SMA 表達的影響

TGF-β1和α-SMA的陽性表達均表達在HSC-T6 細胞胞漿內(nèi)，DAB顯為黃色。25%hUCMSCs上清液組(見圖4B)、50%hUCMSCs上清液組(見圖4C)和對照組(見圖4A)相比，25%hUCMSCs上清液組TGF-β1的陽性表達減少，但無顯著性差異(P>0.05)， 50%hUCMSCs上清液組TGF-β1的陽性表達明顯減少，差異顯著(P<0.05)(見圖4H)； 25%hUCMSCs上清液組(圖4E)、50%hUCMSCs上清液組(圖4F)和對照組(圖4D)相比，25%hUCMSCs上清液組α-SMA的陽性表達減少，但無顯著性差異(P>0.05)，50%hUCMSCs上清液組α-SMA的陽性表達明顯明顯減少，差異顯著(P<0.05)(見圖4H)。

A為對照組TGF-β1;B為25%hUCMSCs上清液組TGF-β1;C為50%hUCMSCs上清液組TGF-β1 D為對照組α-SMA;E為25%hUCMSCs上清液組α-SMA;F為25%hUCMSCs上清液組α-SMA;H為3組平均光密度對比圖*:與對照組比較P<0.05

圖4hUCMSCs上清液對HSC-T6細胞中TGF-β1、α-SMA表達的影響

3 討論

肝纖維化[12，13]是由各種致病因素引起肝細胞變性、壞死，導致炎癥反應，刺激纖維組織異常增生而形成的病理過程，我國是世界上慢性肝病發(fā)病率最高的地區(qū)之一，目前慢性肝病的治療缺乏有效措施，因而急需研究和探索新的肝病治療技術(shù)[14，15]。

目前研究表明，肝纖維化過程是可逆的[16，17]，肝星狀細胞的異常激活并導致細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過量積聚是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[18，19]。抑制肝星狀細胞的增殖或促進其凋亡,抑制其分泌細胞外基質(zhì)或促進細胞外基質(zhì)降解，是阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進程的關(guān)鍵[20-22]。

本研究通過組織塊貼壁法獲得的細胞，經(jīng)形態(tài)學、表面抗原、分化能力等鑒定為間充質(zhì)干細胞，可常規(guī)凍存、復蘇。通過hUCMSCs上清液與HSC-T6共培養(yǎng)的方法檢測hUCMSCs上清液對HSC-T6細胞的影響，MTT結(jié)果表明，hUCMSCs上清抑制HSC-T6的增殖，且與hUCMSCs上清液的濃度與時間成正比。Annexin V-FITC/PI 雙染方法檢測表明，hUCMSCs上清液促進HSC-T6 細胞凋亡，且hUCMSCs上清的濃度越高，HSC-T6 細胞凋亡比率越高。這表明，hUCMSCs上清液可明顯抑制HSC-T6 細胞的生長。

在此過程中，hUCMSCs上清液是否可抑制肝星狀細胞的激活？α-SMA是肝星狀細胞活化的標志蛋白，為此，本研究檢測了HSC-T6 細胞α-SMA的表達。免疫組化結(jié)果顯示，50%hUCMSCs組α-SMA 的表達明顯降低，這表明，hUCMSCs上清液可抑制HSC-T6 細胞的活化。

TGF-β1是炎癥條件下誘導肝星狀細胞活化的重要信號分子,TGF-β1激活后，能夠快速與肝星狀細胞表面的受體相結(jié)合，導致肝星狀細胞激活，在TGF-β1持續(xù)刺激下造成細胞外基質(zhì)(如膠原纖維)的大量合成[12],形成肝纖維化。hUCMSCs上清液抑制肝星狀細胞活化的作用機制是否與其能抑制TGF-β1的表達相關(guān)？為此，本研究檢測了hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞TGF-β1表達的影響。免疫組化結(jié)果顯示，50%hUCMSCs上清液組HSC-T6 細胞TGF-β1的表達較對照組明顯降低，這表明，hUCMSCs上清液可明顯抑制HSC-T6 細胞TGF-β1的表達。

上述結(jié)果表明，一方面，hUCMSCs上清液能夠抑制HSC-T6 細胞的生長、促進其凋亡，使活化的肝星狀細胞數(shù)量下降；另一方面，hUCMSCs上清液能夠抑制TGF-β1在活化的肝星狀細胞的表達，則抑制了TGF-β1 與肝星狀細胞表面的受體相結(jié)合，導致活化的肝星狀細胞合成細胞外基質(zhì)的能力下降。hUCMSCs上清液通過上述兩方面的作用，抑制了HSC-T6細胞的生長。