表面等離子體共振技術(shù)測(cè)定豬肉中磺胺二甲嘧啶

俞 婧，范素芳,*，李 強(qiáng)，馬俊美，石偉杰，孟志娟，張 騰，張 巖,*

（1.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091；2.北京中龍益誠(chéng)科技有限公司，北京 100071）

磺胺類藥物是一類具有對(duì)氨基苯磺酰胺的藥物總稱[1]，具有抗菌譜廣、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)和獸醫(yī)臨床治療[2-3]?；前范奏奏ぃ╯ulfamethazine，SM2）具有抗菌力強(qiáng)、毒性小等優(yōu)點(diǎn)，是畜牧養(yǎng)殖中應(yīng)用最為廣泛的磺胺類藥物之一[4]?；前奉愃幬锏亩拘暂^高，而且半衰期比較長(zhǎng)[5]，長(zhǎng)期食用被磺胺類藥物污染的水和食物，人體會(huì)產(chǎn)生耐藥性并能引發(fā)過敏反應(yīng)[6]?；前奉愃幬锏臍埩羟闆r日益受到關(guān)注，許多國(guó)家和地區(qū)制定了磺胺類藥物的最大殘留限量[7]。國(guó)際食品法典委員會(huì)和歐美許多國(guó)家規(guī)定動(dòng)物組織中磺胺類藥物的殘留總量不能超過100 μg/kg[8]，日本規(guī)定不能超過20 μg/kg[9]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告規(guī)定，牛乳中SM2的最大殘留限量為25 μg/kg，動(dòng)物源食品中磺胺類藥物總量的最大殘留限量為100 μg/kg[2,10-11]。

目前，磺胺類藥物的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[4-5,7,12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1-3,10]、液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[8-9]等傳統(tǒng)的儀器分析法和酶聯(lián)免疫法[13]、化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法[11]、分子印跡二維光子晶體水凝膠傳感器法[6]等快篩方法。儀器分析方法準(zhǔn)確、靈敏，但前處理過程繁瑣、操作專業(yè)性強(qiáng)、儀器設(shè)備昂貴，不適合基層推廣應(yīng)用。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且需要二抗標(biāo)記，底物和硫酸對(duì)操作人員有害。表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器是一種常用于生物大分子探測(cè)與分析的消逝波傳感器，具有靈敏度高、實(shí)時(shí)性好、無需標(biāo)記、樣品用量少、樣品制備時(shí)間短、便攜等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。SPR已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)，如蛋白質(zhì)、血糖、微生物、氣體檢測(cè)[16]、血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白檢測(cè)[17]和生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境中小分子檢測(cè)[18]以及食品安全領(lǐng)域檢測(cè)，如牛乳中三聚氰胺和磺胺[19-21]、花生中黃曲霉毒素B1[22]、油品種類[23]、β-興奮劑[24-26]、水樣品中莠去津[27]、肉類中泰樂霉素和磺胺[28-29]、食源性化學(xué)危害物檢測(cè)等[30]。本研究采用SPR技術(shù)，利用競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)原理，建立豬肉樣品中SM2的快速篩查方法，為現(xiàn)場(chǎng)抽檢提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SM2標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國(guó)Sigma公司；SM2單克隆抗體和SM2-BSA偶聯(lián)物 河北省科學(xué)院；實(shí)驗(yàn)用水均為屈臣氏純凈水。

豬肉樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)爻校媒M織粉碎機(jī)磨碎后備用。

1.2 儀器與設(shè)備

生物芯片、YC-SPR-A1生物分子互作儀 北京中龍益誠(chéng)科技有限公司；BPX-162恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；3K 15離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 SM2生物芯片的制備

生物芯片表面修飾有L-半胱氨酸連接的納米金（Aunanoparticles，Au-NP）顆粒。取出Au-NP芯片，用去離子水沖洗，清洗表面，氮吹干燥；取80 μL 1.0 mg/mL的SM2-BSA，滴到Au-NP芯片表面，37 ℃孵育1 h，用去離子水沖洗Au-NP芯片，氮吹干燥；Au-NP芯片表面加3% BSA，封閉未作用位點(diǎn)，避免非特異吸附，芯片用去離子水沖洗后37 ℃孵育1 h；取出芯片，氮?dú)獯蹈珊蟠谩?/p>

1.3.2 SM2芯片固定抗原濃度及測(cè)試液抗體濃度的選擇

在Au-NP芯片表面修飾不同質(zhì)量濃度的SM2-BSA（0.7、1.0、1.5 mg/mL），按1.3.1節(jié)中的步驟制備芯片，配制不同質(zhì)量濃度（5、10、15、30 μg/mL）抗體標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)芯片進(jìn)行測(cè)試，綜合考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，選擇最終的抗原質(zhì)量濃度和抗體質(zhì)量濃度。

1.3.3 再生條件和進(jìn)樣條件

分別考察10 mmol/L Gly（甘氨酸）-HCl（pH 2.0～2.5）、50 mmol/L NaOH和100 mmol/L NaOH作為再生液時(shí)儀器的響應(yīng)情況，再生液體積100 μL，流速400 μL/min，用芯片的洗脫結(jié)果和再生次數(shù)評(píng)價(jià)再生效果。樣品測(cè)定時(shí)的進(jìn)樣體積為200 μL，進(jìn)樣速率為20 μL/min。每次的樣品測(cè)定時(shí)間為12.5 min。

1.3.4 樣品前處理

稱?。?.00±0.02） g研磨好的豬肉樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，30 ℃條件下超聲輔助提取20 min，9 500 r/min條件下離心5 min；取5 mL上清液，于50 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干；加入1 mL正己烷復(fù)溶樣品，并轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中，加入等體積的0.01mol/L PBS緩沖液，渦旋混勻1 min，9 500 r/min條件下離心5 min；取下層水相，與等體積抗體混合均勻后，待測(cè)。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

豬肉樣品基質(zhì)較復(fù)雜，非特異性吸附較多，按照1.3.4節(jié)的樣品前處理方法處理空白豬肉樣品，得到空白基質(zhì)提取液，用該空白基質(zhì)提取液配制不同質(zhì)量濃度的SM2標(biāo)準(zhǔn)溶液，將SM2標(biāo)準(zhǔn)溶液與等質(zhì)量濃度的抗體等體積混合，混合溶液中SM2的最終質(zhì)量濃度分別為0、6.25、10.00、12.50、25.00 ng/mL。測(cè)定時(shí)的進(jìn)樣體積200 μL，進(jìn)樣流速20 μL/min，讀取各樣品的SPR響應(yīng)值。

1.3.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在（2.00±0.02） g豬肉中加入質(zhì)量濃度為10 μg/mL的SM2標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為10、20、100 μg/kg，每個(gè)水平3 個(gè)平行。樣品經(jīng)前處理后，與抗體溶液等體積混合，進(jìn)樣，測(cè)得響應(yīng)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)際測(cè)得濃度，并計(jì)算回收率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel 2010軟件，圖形繪制采用OriginLab 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 SM2芯片固定抗原濃度及測(cè)試液抗體濃度的優(yōu)化結(jié)果

由表1可知，雖然當(dāng)抗體和抗原質(zhì)量濃度增大時(shí)，儀器響應(yīng)值相應(yīng)增大，但SM2標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度較小時(shí)，由于抗體質(zhì)量濃度過大，梯度不明顯，因此抗體及抗原的質(zhì)量濃度不宜過大?？乖|(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，分別通入質(zhì)量濃度為10.0、15.0、30.0 μg/mL的抗體溶液，儀器響應(yīng)值分別為69.732、81.125、118.326。在抗體質(zhì)量濃度為30.0 μg/mL時(shí)，儀器響應(yīng)值最大，但考慮到抗體成本問題，選取15.0 μg/mL的抗體作為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的反應(yīng)濃度。在3 片芯片上分別修飾1.5、1.0、0.7 mg/mL的SM2-BSA，通入15.0 μg/mL的抗體，儀器響應(yīng)值分別為82.306、67.325、62.475，可以看出，隨著抗原質(zhì)量濃度的增大，抗體的反應(yīng)響應(yīng)值也有一定程度的增大。

表1 不同質(zhì)量濃度抗原、抗體條件下的儀器響應(yīng)值Table 1 Instrumental response at different concentrations of antigen and antibody

芯片固定抗原質(zhì)量濃度及測(cè)試液抗體質(zhì)量濃度的確定還會(huì)影響方法的靈敏度及線性范圍。在抗體質(zhì)量濃度15.0 μg/mL、抗原質(zhì)量濃度1.5 mg/mL條件下繪制所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.047 0x2-1.099 6x+84.147 0（R2=0.976 8）。SM2標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度較小時(shí)，響應(yīng)值區(qū)分不明顯，這可能是抗體或抗原過量造成的，于是進(jìn)一步降低抗體和抗原的質(zhì)量濃度，把抗體質(zhì)量濃度降為10.0 μg/mL，抗原質(zhì)量濃度降為0.7 mg/mL，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.014 7x2-2.263 2x+94.721 0（R2=0.983 6）。當(dāng)抗體和抗原質(zhì)量濃度均下降時(shí)，小質(zhì)量濃度SM2標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值可以明顯區(qū)分開，這可能是由于芯片的空間位阻效應(yīng)變小，抗體的結(jié)合效率更高。

對(duì)表1中的數(shù)據(jù)分別作不同處理間顯著水平為0.05的成對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，抗體質(zhì)量濃度為15.0 μg/mL、抗原質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL和抗體質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL、抗原質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL時(shí)沒有顯著差異，其他處理組之間均存在顯著差異。因此最終選擇抗體質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL，抗原質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL。

2.2 不同再生條件對(duì)芯片使用次數(shù)的影響

圖1 SPR檢測(cè)過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of SPR detection process

由圖1可知，SPR檢測(cè)過程分為抗體與芯片表面抗原的結(jié)合、解離和再生，以再生后儀器響應(yīng)值能否回到芯片未結(jié)合抗體以前的響應(yīng)值為判斷標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)洗脫是否徹底。再生的目的是破壞SM2-BSA與SM2抗體的非共價(jià)結(jié)合，當(dāng)選用條件溫和的Gly-HCl緩沖液（pH 2.0～2.5）時(shí)，SM2-BSA與SM2抗體不能徹底分離；使用50 mmol/L NaOH和100 mmol/L NaOH作為再生液時(shí)，通過檢測(cè)芯片可再生次數(shù)與SPR響應(yīng)值考察2 種再生液的洗脫再生效果，采用最佳抗原、抗體質(zhì)量濃度。

圖2 再生次數(shù)對(duì)SM2芯片響應(yīng)值的影響Fig.2 Effect of regeneration cycles on SM2 chip response

由圖2可知：使用50 mmol/L NaOH作為再生液時(shí)，再生次數(shù)達(dá)到20 次以上時(shí)，SM2芯片活性下降較快，儀器響應(yīng)值明顯降低；而使用100 mmol/L NaOH作為再生液時(shí)，再生次數(shù)達(dá)到45 次時(shí)，芯片活性仍較好，儀器重復(fù)性良好。因此最終選擇100 mmol/L NaOH作為再生液，在再生液體積100 μL、流速400 μL/min時(shí)，芯片可重復(fù)使用45 次以上。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

抗體質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL、抗原質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度范圍為0～100 μg/L時(shí)擬合的線性方程為y=-0.812 5x+81.954 0（R2=0.795 7），SM2質(zhì)量濃度達(dá)到50 ng/mL時(shí)儀器響應(yīng)值超出線性范圍。標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度范圍為0～25 μg/L時(shí)擬合的線性方程為y=-2.185 5x+95.726 0（R2=0.986 6），線性關(guān)系良好。最終選擇標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度線性范圍為0～25 μg/L。

通過多次測(cè)定空白樣品的本底值來計(jì)算儀器的檢出限，通過空白樣品的本底值計(jì)算出的質(zhì)量濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)偏差為σ，3σ對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度即為該儀器的檢出限。計(jì)算得到儀器的檢出限為2 ng/mL，對(duì)應(yīng)的方法檢出限為4 μg/kg，方法定量限為10 μg/kg，方法的線性范圍為10～50 μg/kg，質(zhì)量濃度超出線性范圍時(shí)需對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

由表2可知，方法的回收率范圍為87.6%～107.4%，RSD均小于11.00%，符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中對(duì)不同添加水平回收率的要求。

表2 方法的回收率Table 2 Recoveries of the method

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

表3 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果Table 3 Sulfamethazine contents of real samples

從超市和菜市場(chǎng)購(gòu)買10 份豬肉樣品，分別采用本研究中的方法和GB/T 21316—2007《動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》中的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定。由表3可知，檢測(cè)結(jié)果均為未檢出，即測(cè)定結(jié)果低于方法檢出限。用本研究中的方法和GB/T 21316—2007本研究中的方法對(duì)理論值為80 μg/kg的質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)測(cè)定5 次，質(zhì)控樣測(cè)定結(jié)果分別為77.3～80.3 μg/kg和78.9～81.0 μg/kg，說明SPR法與國(guó)標(biāo)方法的測(cè)定結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

本研究建立了基于SPR技術(shù)的豬肉中SM2的測(cè)定方法。該方法的線性范圍、準(zhǔn)確度和精密度均符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中的相關(guān)要求。該生物芯片在優(yōu)化好的條件下可重復(fù)使用40 次以上，另外，該方法比較快速，樣品測(cè)定時(shí)間低于15 min。通過對(duì)實(shí)際樣品及質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)定，并經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法確證，表明該方法可用于豬肉中SM2的快速篩查分析。