傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中植物乳桿菌的種群結(jié)構(gòu)及遺傳進化

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(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

乳酸菌因其潛在的益生特性而被廣泛認可。植物乳桿菌是乳酸菌的一種,其兼性厭氧,來源安全,廣泛分布于乳、肉、蔬菜等食材及其發(fā)酵制品中[1-2],此外,還存在于人和動物的消化道中[3]。植物乳桿菌通過發(fā)酵可轉(zhuǎn)化生鮮食品中的營養(yǎng)成分[4],提升營養(yǎng)價值,對食品工業(yè)和人體健康有著多重有益的功效,具有一定的商業(yè)利用價值。

近年來,多種分子分型方法被廣泛應(yīng)用,包括脈沖場凝膠電泳、限制性片段長度多態(tài)性、擴增片段長度多態(tài)性、隨機擴增多態(tài)性DNA等。但這些方法針對相似營養(yǎng)需求或相近生態(tài)位的菌株,其得到的圖譜可能是不準(zhǔn)確的[5]。多位點序列分型技術(shù)(multilocus sequence typing,MLST)是菌株種內(nèi)分型的強有力工具[6]。它衍生自多位點酶電泳法,基于部分持家基因,可有效探索菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、遺傳進化以及種群結(jié)構(gòu)[7-8]。持家基因是維持細胞基本生命活動所必須的基因,其在所有細胞中均穩(wěn)定表達。在MLST研究中,所選擇的持家基因需滿足以下條件:具有保守的編碼蛋白的能力;均勻分布于整個基因組;單拷貝,長度不短于1 kb[7]。MLST技術(shù)首先應(yīng)用于流行病學(xué)領(lǐng)域,用于致病菌的進化和種群生物學(xué)研究,而后拓展至乳酸菌的多樣性和系統(tǒng)進化分析。乳酸菌中利用此法完成分析的菌株包括干酪乳桿菌、德氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、舊金山乳桿菌、乳明串珠菌等[7,9-12]。對于植物乳桿菌,已有學(xué)者對分離自水果、蔬菜、青貯等材料的菌株進行MLST分析[13-14]。

本文利用MLST方法,選取7個持家基因,對分離自內(nèi)蒙古和西藏自治區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的植物乳桿菌的種群結(jié)構(gòu)和遺傳進化進行分析,從而在基因水平上為菌株的分型和工業(yè)食品發(fā)酵劑的篩選提供參考,為后續(xù)益生菌發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

61株植物乳桿菌分離株 56株分離自內(nèi)蒙古和西藏自治區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中,1株模式菌株L.plantarumATCC 14917T,4株參考菌株L.plantarumWCFS1、L.plantarumP-8、L.plantarumZJ316和L.plantarumJDM1;MRS肉湯培養(yǎng)基 Sigma公司;磷酸鹽緩沖液 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;2×Taq PCR MasterMix 北京天根生物技術(shù)有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司。

YQX-II型厭氧培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Bcn1360型生物超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;高速冷凍離心機 上海離心機械研究所;7000 PCR擴增儀 美國Applied Biosystems公司;NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo分光光度計公司;渦旋震蕩器 Mo-Bio公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 持家基因的選擇 本研究采用7個持家基因,其中4個基因(pheS、groEL、murC、murE)及其引物是引用Xu等[15]的研究,其余3個基因(recA、recG、ileS)則是選自德氏乳桿菌的MLST研究[9],并以L.plantarumWCFS1的持家基因的基因片段為模板,利用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計。所選擇的持家基因及其引物信息見表1。

表1 植物乳桿菌多位點序列分型的持家基因及其引物Table 1 The information of housekeeping genes and primers for MLST of L. plantarum

1.2.2 菌株的培養(yǎng) 將甘油凍存的植物乳桿菌分離株,接種至MRS肉湯培養(yǎng)基,置于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h,經(jīng)傳2代培養(yǎng)至對數(shù)期,取2 mL菌液離心后倒掉上清,待用。

1.2.3 DNA的提取、擴增及測序 采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取總基因組DNA,具體步驟按照說明書進行操作。使用表1中的引物進行PCR擴增,擴增體系為50 μL,包括16 μL 2×Taq PCR MasterMix,各1 μL引物,4 μL DNA模板,以雙蒸水補足體積。擴增條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,適宜退火溫度(表1)30 s,72 ℃延伸30 s,30個循環(huán);72 ℃末端延伸5 min。擴增后的產(chǎn)物經(jīng)1%的凝膠電泳進行檢測,將條帶匹配的產(chǎn)物送至北京諾賽生物科技有限公司,進行純化及雙向測序。模式菌株和參考菌株的持家基因序列直接從NCBI數(shù)據(jù)庫下載獲得。

1.3 數(shù)據(jù)分析

一個獨特的核酸序列分配一個等位基因號,7個持家基因的不同等位基因號組合構(gòu)成一個獨特的等位基因譜,也就是序列型(sequence type,ST)。利用MEGA 7.0軟件對序列進行修剪和比對,進而得出等位基因圖譜。利用DnaSP和START軟件計算多態(tài)位點數(shù)、Tajima’s D值、G+C含量(%)、核酸多態(tài)性(π)、非同義突變與同義突變比率(dN/dS)以及IA(index of association)。采用eBURST軟件對ST型進行克隆復(fù)合體歸類分析。用MEGA和STRUCTURE對分離株進行系統(tǒng)發(fā)育和祖先種群結(jié)構(gòu)探索。采用SplitTree分析菌株的重組情況及遺傳進化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸多樣性分析

等位基因遺傳多樣性相關(guān)系數(shù)如表2所示。7個位點的等位基因數(shù)處于3～10之間,pheS基因多樣性較豐富。多肽位點數(shù)在3(recG)～12(pheS)之間,π值處在0.00219(groEL)至0.00720(ileS)之間,顯示出較低的位點突變率。Tajima’s D值在-1.33698(groEL)和-0.11553(pheS)之間,均小于0,表明基因序列在進化過程中受定向選擇。G+C含量是細菌遺傳進化研究中的重要指標(biāo),本研究中7個基因序列的G+C含量在42.86%(groEL)和50.99%(murE)之間,平均含量為44.88%,高于模式菌株L.plantarumATCC 14917T的G+C含量(44.50%),表明持家基因的保守性較好。同義突變指核苷酸的變異不會引起所編碼的氨基酸的改變,非同義突變指核苷酸的變異會導(dǎo)致氨基酸的改變,本研究中dN/dS均小于1,位于0.021(ileS)～0.927(murC)之間,表明基因變異不會引起氨基酸的變化,其非同義突變受純化選擇,此7個持家基因可用于植物乳桿菌的MLST研究。以上遺傳多樣性相關(guān)系數(shù)揭示了這些基因處于穩(wěn)定化選擇[10,12]。

表2 持家基因的遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity at L. plantarum loci

2.2 序列型和克隆復(fù)合體

不同等位基因的不同組合共分成27個ST型,其中的20個ST型只對應(yīng)單一菌株。根據(jù)生成的等位基因圖譜,利用eBURST軟件規(guī)劃克隆復(fù)合體來探索菌株的遺傳進化關(guān)系。圖1 eBURST圖譜中,每個點代表一個ST型,數(shù)字代表該點所對應(yīng)的ST型編號,點的大小與所對應(yīng)ST型的菌株數(shù)量成正比。7個等位基因中,不少于5個相同等位基因號的ST型劃分為一個克隆復(fù)合體(clonal complex,CC)。27個ST型共歸為6個CCs和6個獨特型(singleton)。CC1、CC2、CC4、CC9、CC10和CC23包含90.9%的分離株。在CC1中,ST-1占據(jù)中心位置,包含最多菌株數(shù)(28株),被認為是CC1的原始序列型。CC1中的多數(shù)菌株來自于西藏自治區(qū),而在CC3中則多是分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)。ST-10包含兩株分離自發(fā)酵乳制品的菌株以及參考菌株L.plantarumP-8,表明來自同一原料的菌株是極為相近的。分離自青貯的參考菌株L.plantarumJDM1同分離自發(fā)酵乳制品中的菌株ST-17以單位點差異而共居于CC4,可能是因為它們生活在鄰近的生態(tài)位。源自人唾液的L.plantarumWCFS1,健康嬰兒糞便的L.plantarumZJ316以及模式菌株L.plantarumATCC 14917T均是獨特型。綜上分析,可認為相同分離源、分離地的菌株具有相似的核酸多樣性,換言之,不同原料、不同加工方式會影響植物乳桿菌的遺傳進化,加速其對特殊生存環(huán)境的適應(yīng)性。在舊金山乳桿菌和干酪乳桿菌的MLST研究中,提出了加工環(huán)境是細菌進化過程中影響其生存適應(yīng)性的重要因素[7,11]。然而,也有研究學(xué)者表示進化和菌株分離源之間并沒有關(guān)系[10,13]。而本研究中的菌株是采樣于相對較窄的生態(tài)位,因此得出的結(jié)論還需進一步驗證。針對這個問題,未來的研究方向會關(guān)注于更多樣的分離源、分離地域。

圖1 基于等位基因圖譜的eBURST分析Fig.1 eBURST analysis based on allelic profiles

2.3 種群結(jié)構(gòu)

通過MEGA軟件,采用鄰接法對串聯(lián)的序列片段進行聚類分析的結(jié)果與利用STRUCTURE評估的種群結(jié)構(gòu)具有較好的一致性(圖2),27個ST型共分成4個遺傳譜系。2B圖中每行代表一個ST型,不同的顏色代表不同的祖先來源。Cluster 1包含13個ST型,其中的菌株多數(shù)源自內(nèi)蒙古發(fā)酵乳制品,其中還包含參考菌株L.plantarumP-8、L.plantarumZJ316和L.plantarumATCC 14917T。Cluster 2僅含有1個ST型,包含單一菌株L.plantarumWCFS1。從圖2B中可以看出,超過半數(shù)的菌株是單一祖先來源,即每個橫線單一顏色有至少85%的占比。剩余的ST型則是由混合的祖先群體構(gòu)成,在遺傳重組過程中,每一個顏色所代表的祖先群體既可以是捐贈者也可以是獲得者,因而分離株中呈現(xiàn)了異質(zhì)的祖先群體結(jié)構(gòu)。Xu等也得出了相同的結(jié)論,重組可導(dǎo)致遺傳信息的異質(zhì)性[15]。

圖2 進化樹及種群結(jié)構(gòu)Fig.2 Evolutionary tree and population structure注:A:基于串聯(lián)基因序列獲得的N-J樹;B:由STRUCTURE獲得的祖先來源譜系。

2.4 重組分析

利用IA對植物乳桿菌分離株進行連鎖失衡分析,若IA的值顯著不同于0,則存在克隆結(jié)構(gòu),期望值為1,反之則存在重組導(dǎo)致的連鎖平衡,期望值為0。本研究中IA和IAS的值分別為1.4364和0.2394(p=0.000),表現(xiàn)出強烈的連鎖失衡,表明這些基因中存在克隆結(jié)構(gòu)。此現(xiàn)象也發(fā)生在其他乳酸菌的MLST研究中,如乳酸乳球菌、乳明串珠菌等[12,16]。同樣,在地衣芽孢桿菌和嗜熱鏈球菌中也已被證實存在[17-18]。

采用重組分解分析來探究分離株的重組現(xiàn)象,在分解分裂圖上,若出現(xiàn)相互交錯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或平行四邊形結(jié)構(gòu)則說明重組參與其進化。若出現(xiàn)樹狀圖形,則說明該譜系是克隆結(jié)構(gòu)。在單基因的分解分裂圖上,pheS出現(xiàn)了平行四邊形結(jié)構(gòu),而其余6個基因則是樹狀結(jié)構(gòu),說明pheS基因在進化過程中存在重組,剩余6個基因則無明顯的重組現(xiàn)象。針對于pheS基因,在乳明串珠菌的多位點序列分型研究中也發(fā)現(xiàn)了重組現(xiàn)象[12]。對串聯(lián)的持家基因序列進行重組分解分析,在分解分裂圖上可以明顯的看到網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3),證明植物乳桿菌分離株在遺傳進化過程中受重組影響。并且在植物乳桿菌基因組中存在質(zhì)粒和一些移動元件,也可能有益于重組的發(fā)生[19]。27個ST型分成4組,與進化樹及種群結(jié)構(gòu)譜系的結(jié)果相一致。

圖3 重組分解分析Fig.3 Split-decomposition analysis

3 結(jié)論

MLST技術(shù)是一種有效且分辨率較高的分型方法,被廣泛用于探究菌株的基因多樣性、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、遺傳進化及種群結(jié)構(gòu)。本文基于7個持家基因序列，對分離自內(nèi)蒙古和西藏自治區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的61株分離菌進行遺傳進化和種群結(jié)構(gòu)探索,在這些分離株的基因上,具有較高的遺傳多樣性,存在克隆結(jié)構(gòu),且重組影響其遺傳進化。本研究從基因水平為菌株的分型和工業(yè)食品發(fā)酵劑的篩選提供了新的理論與技術(shù)支持,且通過分離得到的植物乳桿菌純化菌株可作為潛在乳酸菌發(fā)酵劑,為后續(xù)益生菌發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)提供菌種資源。